本文關(guān)鍵詞：漢灘病毒重組假病毒的構(gòu)建及包膜蛋白糖基化對(duì)病毒免疫學(xué)性狀影響的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：病毒包膜蛋白是鑲嵌于病毒脂質(zhì)雙層膜中各種蛋白質(zhì)分子的統(tǒng)稱(chēng),由于糖基化修飾普遍存在于各種病毒的包膜蛋白,因此病毒包膜蛋白常被稱(chēng)為病毒包膜糖蛋白(Envelope glycoprotein, GP),在病毒結(jié)構(gòu)蛋白中占有重要的地位。迄今為止的研究表明：病毒GP分子表面糖側(cè)鏈的種類(lèi)、糖基化的方式及糖基化程度對(duì)病毒的致病性、病毒顆粒的組裝、成熟、釋放、病毒的免疫逃避、抗病毒免疫等具有至關(guān)重要的作用。近年來(lái),隨著糖組學(xué)研究的興起,與病毒GP和糖基化相關(guān)的研究,受到眾多研究者的普遍關(guān)注,也已成為當(dāng)前分子病毒學(xué)研究的熱點(diǎn)課題。為此,本文從以下兩個(gè)方面初步研究了包膜糖蛋白多個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)突變對(duì)漢灘病毒(Hantaanvirus, HTNV)體液與細(xì)胞免疫活性的影響。一、HTNV包膜多個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)突變型重組假病毒的構(gòu)建與活性鑒定在前期研究工作的基礎(chǔ)上,首先運(yùn)用一次性多位點(diǎn)同時(shí)突變法,對(duì)HTNV GP Gn、 Gc編碼基因上的5個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)(GnN134、N235、N347、 N399和GcN928)同時(shí)進(jìn)行突變,成功構(gòu)建了5個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)的共突變體；采用第三代4質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組假病毒rLV-M(攜帶N-連接糖基化位點(diǎn)未突變M基因)、重組假病毒rLV-M'(攜帶5個(gè)N=連接糖基化位點(diǎn)全突變M基因)和重組假病毒rLV(空載體對(duì)照)等三種假病毒株,病毒滴度分別為4.0×107TU/ml,2.0×107TU/ml 和 1.0×108TU/ml。二、多個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)突變對(duì)HTNV包膜糖蛋白免疫學(xué)性狀影響的研究用9種免疫原：rLV-M、 rLV-M+佐劑、rLV-M'、rLV-M'+佐劑、rLV、rLV+佐劑、佐劑、NS、滅活疫苗以后肢肌肉內(nèi)多點(diǎn)注射方式,接種C57BL/6小鼠。ELISA法和微量細(xì)胞中和試驗(yàn)證實(shí),我們所構(gòu)建的重組假病毒可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠產(chǎn)生特異性的抗HTNV體液免疫應(yīng)答,rLV-M免疫組抗HTNV特異性抗體GMT達(dá)到1：1386,中和抗體GMT為1：160,rLV-M’免疫組HTNV特異性抗體GMT為1：587,中和抗體GMT為1：113,均顯著高于滅活疫苗免疫組的1：269和1：28。在本研究中我們運(yùn)用ELISPOT法,分別檢測(cè)了重組假病毒rLV-M和重組假病毒rLV-M'免疫小鼠脾細(xì)胞的IFN-γ分泌水平。同時(shí),運(yùn)用CTL殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的特異性殺傷活性。結(jié)果顯示,兩種方法的檢測(cè)結(jié)果呈明顯的正相關(guān),在IFN-γ分泌水平和特異性CTL殺傷活性?xún)蓚�(gè)反映細(xì)胞免疫功能的檢測(cè)指標(biāo)上,滅活疫苗免疫小鼠組均遠(yuǎn)遠(yuǎn)的高于重組假病毒rLV-M 與 rLV-M’免疫小鼠組,rLV-M'免疫小鼠組又顯著高于rLV-M免疫小鼠組。動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,用攜帶HTNV M基因(無(wú)論突變與否)的重組假病毒進(jìn)行免疫,均可為HTNV感染的小鼠提供一定程度的特異性免疫保護(hù),但這種特異性免疫保護(hù)活性的強(qiáng)度遠(yuǎn)低于商品化滅活疫苗,而rLV-M'對(duì)小鼠的特異性免疫保護(hù)活性要顯著優(yōu)于rLV-M免疫組。通過(guò)本實(shí)驗(yàn),可做出如下推論,5個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)的同時(shí)突變對(duì)HTNV Gn、Gc誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗HTNV特異性抗體和中和抗體的滴度有明顯下降,而反映細(xì)胞免疫應(yīng)答水平的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo),均高于M基因糖基化位點(diǎn)未突變的對(duì)照組。顯示,多個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)的突變,對(duì)HTNV GP抗原性和免疫原性的影響,有一定程度的復(fù)合與疊加效應(yīng),但遠(yuǎn)不如我們所預(yù)期的那樣明顯。這需要我們?cè)谥泻托钥乖砦慌cN-連接糖基化位點(diǎn)的空間關(guān)系、糖側(cè)鏈與抗原表位活性等方面做更深入、精細(xì)的研究。
【關(guān)鍵詞】：漢灘病毒 包膜糖蛋白 N-連接糖基化位點(diǎn) 突變 重組假病毒
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R373
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 縮略語(yǔ)8-14
• 第一章 緒論14-28
• 1.1 前言14-15
• 1.2 漢坦病毒的結(jié)構(gòu)與功能15-19
• 1.2.1 漢坦病毒的形態(tài)與結(jié)構(gòu)研究15-17
• 1.2.2 漢坦病毒包膜糖蛋白的主要生物學(xué)特性17-19
• 1.3 糖蛋白與糖基化19-21
• 1.3.1 蛋白質(zhì)的糖基化19-20
• 1.3.2 蛋白質(zhì)的糖基化類(lèi)型20-21
• 1.4 病毒包膜糖蛋白與糖基化研究21-25
• 1.4.1 病毒糖蛋白糖基化與功能研究21-24
• 1.4.2 漢坦病毒包膜糖蛋白的糖基化研究24-25
• 1.5 重組假病毒技術(shù)25-28
• 1.5.1 假病毒的特性和優(yōu)勢(shì)25
• 1.5.2 假病毒的制備方法和載體系統(tǒng)25-26
• 1.5.3 重組假病毒技術(shù)在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用26-28
• 第二章 HTNV包膜糖蛋白多糖基化位點(diǎn)突變型重組假病毒的構(gòu)建與活性鑒定28-42
• 2.1 材料28-31
• 2.1.1 質(zhì)粒和菌種28
• 2.1.2 細(xì)胞和載體28-29
• 2.1.3 主要試劑29-30
• 2.1.4 培養(yǎng)液30-31
• 2.1.5 常用緩沖液系統(tǒng)與溶液31
• 2.1.6 主要儀器和器材31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法31-35
• 2.2.1 構(gòu)建多糖基化位點(diǎn)共突變體模板的制備32-34
• 2.2.2 重組HTNV假病毒的包裝34-35
• 2.2.3 重組假病毒的培養(yǎng)、擴(kuò)增及滴度測(cè)定35
• 2.2.4 重組假病毒表達(dá)產(chǎn)物的鑒定—免疫熒光實(shí)驗(yàn)35
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-39
• 2.3.1 HTNV M基因多糖基化位點(diǎn)的突變結(jié)果35-36
• 2.3.2 重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果36-37
• 2.3.3 假病毒顆粒包裝結(jié)果37-38
• 2.3.4 重組假病毒滴度測(cè)定結(jié)果38
• 2.3.5 重組假病毒表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果38-39
• 2.4 討論39-42
• 第三章 多糖基化位點(diǎn)突變對(duì)HTNV包膜糖蛋白免疫學(xué)活性的影響42-60
• 3.1 材料42-43
• 3.1.1 假病毒株42
• 3.1.2 細(xì)胞42
• 3.1.3 病毒株42
• 3.1.4 動(dòng)物42
• 3.1.5 抗體及主要試劑42-43
• 3.1.6 其他常用試劑、緩沖液43
• 3.1.7 主要儀器、設(shè)備43
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法43-46
• 3.2.1 動(dòng)物免疫43
• 3.2.2 重組假病毒免疫小鼠血清抗HTNV特異性抗體檢測(cè)——ELISA間接法43-44
• 3.2.3 重組假病毒免疫小鼠血清中和抗體檢測(cè)——微量細(xì)胞培養(yǎng)中和試驗(yàn)44
• 3.2.4 重組假病毒免疫小鼠細(xì)胞因子的檢測(cè)44-45
• 3.2.5 重組假病毒免疫對(duì)HTNV感染小鼠的保護(hù)性試驗(yàn)45
• 3.2.6 免疫小鼠脾細(xì)胞特異性CTL殺傷活性的檢測(cè)45-46
• 3.2.7 統(tǒng)計(jì)分析46
• 3.3 結(jié)果46-53
• 3.3.1 免疫小鼠血清中抗HTNV特異性抗體檢測(cè)結(jié)果46-47
• 3.3.2 免疫小鼠血清中和抗體的檢測(cè)結(jié)果47-48
• 3.3.3 免疫小鼠細(xì)胞因子IFN-γ分泌水平的檢測(cè)結(jié)果48-50
• 3.3.4 免疫小鼠的特異性CTL殺傷試驗(yàn)結(jié)果50-51
• 3.3.5 重組假病毒免疫對(duì)HTNV感染小鼠的保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果51-53
• 3.4 討論53-60
• 3.4.1 免疫小鼠體液免疫水平檢測(cè)結(jié)果53-56
• 3.4.2 免疫小鼠細(xì)胞免疫水平檢測(cè)結(jié)果56-58
• 3.4.3 重組假病毒免疫對(duì)HTNV感染小鼠的保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果58-60
• 小結(jié)60-62
• 參考文獻(xiàn)62-77
• 攻讀碩士學(xué)位期間研究成果77-78
• 致謝78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：252136