本文關(guān)鍵詞：補(bǔ)體C3對巨噬細(xì)胞本身自噬及其自噬弓形蟲的影響和機(jī)制初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自噬對細(xì)胞生存、生長及維持自身穩(wěn)態(tài)是十分重要的。自噬不但是細(xì)胞自身防御和應(yīng)激的調(diào)控機(jī)制,而且與固有免疫及適應(yīng)性免疫有著密切聯(lián)系,并且外源病原體感染可以誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生自噬。目前已證實,自噬與TLR、NLR、RLR等固有免疫組成部分都有密切的相互作用關(guān)系。補(bǔ)體系統(tǒng)作為固有免疫的重要組成部分能夠通過經(jīng)典途徑、凝集素途徑及旁路途徑被激活。這三條途徑均導(dǎo)致C3被活化,并產(chǎn)生活性片段C3a和C5a,進(jìn)而形成C5-C9攻膜復(fù)合物。C3a和C5a都能通過分別與C3a R和C5aR結(jié)合來誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性因子。然而補(bǔ)體與自噬之間的關(guān)系尚未見報道。本課題首先利用表達(dá)EGFP的熒光弓形蟲及C3-/-C57 BL6/J小鼠構(gòu)建了弓形蟲入侵小鼠腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬的實驗平臺,利用Western、激光共聚焦及透射電子顯微鏡等實驗手段觀察對比C3-/-組與對照組自噬水平的變化差異,用流式細(xì)胞術(shù)及激光共聚焦的方法來觀察宿主細(xì)胞自噬對巨噬細(xì)胞殺傷弓形蟲能力的影響。結(jié)果顯示,局部補(bǔ)體C3不僅能夠抑制巨噬細(xì)胞自身的經(jīng)典自噬水平還能抑制巨噬細(xì)胞自噬弓形蟲的水平,并且補(bǔ)體C3對宿主細(xì)胞自噬水平的抑制能夠抑制IFN-γ清除弓形蟲。然后我們還對C3負(fù)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)豐富了我們對自噬與固有免疫之間關(guān)系的認(rèn)識,并十分有利于我們深入理解自噬相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制。一、局部產(chǎn)生的補(bǔ)體C3抑制巨噬細(xì)胞的經(jīng)典自噬及選擇性自噬1.局部產(chǎn)生的補(bǔ)體C3抑制巨噬細(xì)胞的經(jīng)典自噬:收集HBSS培養(yǎng)巨噬細(xì)胞0h、3h、6h、12h、24h的蛋白,通過Western檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3及LAMP-1的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C3-/-組LC3 II/I及LAMP-1的水平明顯高于對照組。2.局部補(bǔ)體C3能抑制巨噬細(xì)胞自噬弓形蟲:弓形蟲入侵巨噬細(xì)胞不同時間點分別利用激光共聚焦觀察統(tǒng)計LC3及LAMP-1與被巨噬細(xì)胞自噬的弓形蟲的共聚率及熒光強(qiáng)度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C3-/-組明顯高于對照組,Western檢測LC3、LAMP-1及P62蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示C3-/-細(xì)胞中LAMP-1、LC3II/LC3I明顯高于WT,而P62則低于WT。3.局部產(chǎn)生的補(bǔ)體C3通過抑制自噬而抑制IFN-γ清除弓形蟲:激光共聚焦及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分析得出,在C3-/-細(xì)胞中弓形蟲的感染率和平均蟲數(shù)都低于WT細(xì)胞。共聚焦結(jié)果顯示自噬促進(jìn)劑Rapamycin和自噬抑制劑3-MA分別能增強(qiáng)和抑制LC3和LAMP-1與弓形蟲的共聚,這說明m TOR和PI3k信號通路影響了巨噬細(xì)胞的特異性自噬。并且自噬抑制劑wortmannin能夠逆轉(zhuǎn)C3抑制IFN-γ殺傷胞內(nèi)弓形蟲的作用,這一結(jié)果說明局部產(chǎn)生的C3是通過抑制自噬來發(fā)揮抑制IFN-γ清除弓形蟲的作用的。二、補(bǔ)體C3影響巨噬細(xì)胞自噬水平的機(jī)制初步探討1.被弓形蟲速殖子入侵的巨噬細(xì)胞中補(bǔ)體活化并產(chǎn)生C3a:ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基上清中補(bǔ)體C3a的表達(dá)水平,對照組細(xì)胞隨時間延長C3a表達(dá)水平逐漸升高,C3-/-組中的C3a表達(dá)水平幾乎為零。2.C5a/C5aR信號通路可能不影響巨噬細(xì)胞自噬弓形蟲的水平:利用共聚焦顯微鏡統(tǒng)計LC3及LAMP-1與入侵巨噬細(xì)胞的弓形蟲速殖子共聚率得出,C5aR-/-組與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。本研究首次報道了補(bǔ)體C3能夠負(fù)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬,并且能夠抑制IFN-γ清除胞內(nèi)弓形蟲。這豐富了我們對固有免疫與自噬之間關(guān)系的認(rèn)識,并且十分有助于我們理解相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：自噬 巨噬細(xì)胞 弓形蟲 補(bǔ)體C3
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392.12
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-14
• 1.1 選題緣由11-12
• 1.2 研究背景12
• 1.3 研究意義12
• 1.4 研究內(nèi)容與方法12-14
• 第二章 補(bǔ)體C3影響巨噬細(xì)胞本身自噬及其特異自噬弓形蟲水平14-32
• 2.1 材料與方法14-18
• 2.2 方法18-23
• 2.3 實驗結(jié)果23-30
• 2.4 討論30-32
• 第三章 補(bǔ)體C3影響巨噬細(xì)胞自噬水平的機(jī)制初步探討32-38
• 3.1 材料與方法32-33
• 3.2 方法33-35
• 3.3 實驗結(jié)果35-37
• 3.4 討論37-38
• 全文總結(jié)38-39
• 參考文獻(xiàn)39-41
• 文獻(xiàn)綜述 弓形蟲自噬的研究進(jìn)展41-47
• 參考文獻(xiàn)45-47
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果47-48
• 致謝48

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本文編號：252134