本文關(guān)鍵詞：PGC-1α通過線粒體ROS和ATP在CH1細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞周期機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)是細(xì)胞能量的主要來源,受損導(dǎo)致ATP產(chǎn)量降低和活性氧ROS的過量產(chǎn)生,進而影響細(xì)胞生長和代謝。Bcl-2定位于線粒體,可消除線粒體ROS積累；而PGC.1a(過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子-1α)是能量調(diào)控途徑中的一個關(guān)鍵因子,主要存在于細(xì)胞核,亦定位于線粒體。但Bcl-2與PGC.1a之間是否相互作用,及PGC-1α調(diào)控能量代謝的機制仍不清楚。因此,本研究旨在調(diào)查PGC-1α是否通過調(diào)控線粒體ATP和ROS水平繼而調(diào)控細(xì)胞周期,以及與Bcl-2是否存在直接或間接關(guān)系。首先我們于小鼠胚胎成纖維CH1細(xì)胞中,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)高表達PGC-1α, siRNA干擾方法降低PGC-1α表達,同時轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pBABE-neO作為對照組,然后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、ROS以及ATP水平。我們發(fā)現(xiàn)過表達PGC-1α具有升高ATP、降低ROS和促進細(xì)胞周期的作用。Westem Blot結(jié)果顯示PGC-1α高表達時,細(xì)胞周期蛋白CyclinB1/D1含量也隨之升高。隨之我們分別改變ATP和ROS,檢測二者是否通過影響細(xì)胞周期蛋白作用于細(xì)胞周期。結(jié)果顯示用寡霉素抑制CH1PGC-1α細(xì)胞中ATP生成,CyclinD1顯著下調(diào)；加入H2O2提高ROS后CyclinB 1顯著下調(diào)。為檢測Bcl-2與PGC-1α的相關(guān)性,我們于小鼠胚胎成纖維NIH3T3細(xì)胞中成功構(gòu)建了Bcl-2穩(wěn)定高表達細(xì)胞株及PB對照組,PGC-lα表達量在正常生長的Bcl-2細(xì)胞和PB對照間無差異；而采用接觸抑制或血清饑餓法同步化細(xì)胞在GO期時,Bcl-2細(xì)胞中PGC-1α蛋白表達量明顯高于對照組；另外,在U251細(xì)胞中干擾下調(diào)Bcl-2表達,PGC-1α表達量降低,表明Bcl-2正調(diào)控PGC-1α。U251細(xì)胞中Bcl-2與PGC-1α均內(nèi)源性高表達,血清饑餓同步化過程中,隨時間延長,PGC-1α表達量下調(diào),Bcl-2表達量逐漸升高；通過siRNA干擾下調(diào)PGC-1α表達,Bcl-2表達量顯著性升高。說明PGC-1α負(fù)反饋Bcl-2的表達變化。我們通過免疫共沉淀進一步檢測Bcl-2與PGC-1α是否相互結(jié)合,結(jié)果顯示全長PGC-1α(110kD)并不與Bcl-2結(jié)合,但在70KDa處檢測到特異性條帶,通過查閱文獻我們猜測其為PGC-1α新型剪切體,具體物質(zhì)還有待進一步研究證明。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)PGC-1α調(diào)控細(xì)胞周期是通過升高ATP水平抑制CyclinD1表達,同時降低ROS水平促進CyclinB1表達而實現(xiàn)。并且PGC-1α可能通過一種新型剪切體與Bcl-2結(jié)合,二者共同作用于線粒體途徑,決定細(xì)胞的命運。以上發(fā)現(xiàn)有望揭示PGC-1α調(diào)控線粒體能量代謝的途徑,并與Bcl-2通過線粒體通路調(diào)控癌癥相關(guān)聯(lián),繼而為發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點,改善線粒體疾病提供可行性研究。
【關(guān)鍵詞】：PGC-1α 線粒體 氧化磷酸化 ATP ROS 細(xì)胞周期 CyclinD1 CyclinB1 Bcl-2
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞對照表8-13
• 第一章 前言13-23
• 1 線粒體13-15
• 1.1 線粒體氧化磷酸化13-14
• 1.2 線粒體ROS產(chǎn)生14-15
• 1.3 線粒體與細(xì)胞周期關(guān)系15
• 2 PGC-1α研究現(xiàn)狀15-19
• 2.1 PGC-1α15-16
• 2.2 PGC-1α與線粒體關(guān)系16-18
• 2.3 PGC-1α與能量調(diào)控關(guān)系18
• 2.4 PGC-1α剪切體的出現(xiàn)18-19
• 3 Bcl-2研究現(xiàn)狀19-22
• 3.1 Bcl-2雙重功能20-22
• 3.1.1 Bcl-2原癌功能20-22
• 3.1.2 Bcl-2抑癌功能22
• 4 本研究目的和意義22-23
• 第二章 PGC-1α通過線粒體ROS及ATP調(diào)控CH1細(xì)胞周期23-49
• 1 材料23-26
• 1.1 細(xì)胞株23
• 1.2 主要試劑及耗材23-24
• 1.3 藥品及試劑盒24
• 1.4 常用試劑配制24-25
• 1.5 主要儀器25-26
• 2 實驗方法26-35
• 2.1 構(gòu)建PGC-1α穩(wěn)定表達細(xì)胞株26-27
• 2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)26
• 2.1.2 病毒包裝和感染26-27
• 2.1.3 感染后細(xì)胞的篩選與凍存27
• 2.2 Western Blot檢測PGC-1α表達27-30
• 2.2.1 Western Blot實驗步驟27-29
• 2.2.2 檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株P(guān)GC-1α蛋白表達29-30
• 2.3 瞬時干擾PGC-1α30-31
• 2.3.1 干擾片段的合成30
• 2.3.2 轉(zhuǎn)染30-31
• 2.4 細(xì)胞計數(shù)31
• 2.5 PGC-1α對線粒體ROS、細(xì)胞內(nèi)ATP及細(xì)胞增殖的影響31-33
• 2.5.1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中線粒體ROS31-32
• 2.5.2 PGC-1α對細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響32-33
• 2.5.3 MTS檢測PGC-1α對細(xì)胞增殖的影響33
• 2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測PGC-1α高表達及干擾處理后細(xì)胞周期時相變化33
• 2.7 PGC-1α高表達及干擾處理后檢測CyclinB1及CyclinD1變化33
• 2.8 改變細(xì)胞ATP對CyclinB1、CyclinD1及細(xì)胞周期的影響33-34
• 2.8.1 降低CH1PGC-1α細(xì)胞株ATP后檢測CyclinB1/D1蛋白變化33-34
• 2.8.2 降低CH1PGC-1α細(xì)胞ATP后流式檢測細(xì)胞周期變化34
• 2.9 改變ROS對CyclinD1、CyclinB1及細(xì)胞周期的影響34-35
• 2.9.1 升高CH1PGC-1α細(xì)胞株ROS后檢測CyclinB1/D1蛋白變化34
• 2.9.2 升高CH1PGC-1α細(xì)胞株ROS后流式檢測細(xì)胞周期變化34-35
• 3 結(jié)果35-45
• 3.1 構(gòu)建PGC-1α穩(wěn)定高表達和瞬時干擾細(xì)胞系35-37
• 3.1.1 蛋白水平檢測穩(wěn)定感染后PGC-1α蛋白表達變化35-37
• 3.1.2 檢測瞬時干擾PGC-1α蛋白37
• 3.2 高表達和干擾PGC-1α后檢測其對線粒體及細(xì)胞功能的影響37-39
• 3.3 高表達和干擾PGC-1α后檢測細(xì)胞周期及cylinD1/B1變化39-41
• 3.4 寡霉素處理CH1PGC-1α細(xì)胞檢測細(xì)胞周期和CyclinD1/B1蛋白變化41-43
• 3.5 H_2O_2處理CH1PGC-1α細(xì)胞檢測細(xì)胞周期和CyclinD1/B1蛋白變化43-45
• 4 討論45-47
• 5 結(jié)論47-49
• 第三章 Bcl-2與PGC-1α相互調(diào)節(jié)49-72
• 1 材料49-51
• 1.1 細(xì)胞株49
• 1.2 主要試劑49-50
• 1.3 儀器設(shè)備及耗材50-51
• 2 方法51-56
• 2.1 構(gòu)建Bcl-2穩(wěn)定表達細(xì)胞株51-52
• 2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)51
• 2.1.2 病毒包裝和感染51-52
• 2.1.3 感染后細(xì)胞的篩選與凍存52
• 2.2 同步化處理細(xì)胞后檢測PGC-1α蛋白變化52
• 2.3 同步化后于U251cell中檢測Bcl-2和PGC-1α表達量變化52-53
• 2.4 干擾處理Bcl-2檢測PGC-1α變化53-54
• 2.4.1 干擾片段合成53
• 2.4.2 轉(zhuǎn)染后檢測PGC-1α表達量53-54
• 2.5 干擾處理PGC-1α檢測Bcl-2變化54
• 2.6 免疫共沉淀檢測Bcl-2與PGC-1α是否結(jié)合54-55
• 2.6.1 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)54-55
• 2.6.2 Western Blot上樣檢測Bcl-2與PGC-1α55
• 2.7 肽指紋圖譜檢測陽性未知蛋白55-56
• 3 結(jié)果56-70
• 3.1 血清饑餓處理后,Bcl-2細(xì)胞中PGC-1α蛋白表達上調(diào)56-58
• 3.2 接觸抑制處理后,Bcl-2細(xì)胞中PGC-1α蛋白表達上調(diào)58-60
• 3.3 血清饑餓處理U251細(xì)胞,Bcl-2和PGC-1α蛋白表達量相關(guān)60-61
• 3.4 瞬時干擾后檢測Bcl-2和PGC-1α蛋白變化61-65
• 3.4.1 瞬時干擾Bcl-2后,PGC-1α蛋白下調(diào)61-63
• 3.4.2 瞬時干擾PGC-1α后,Bcl-2表達上調(diào)63-65
• 3.5 免疫共沉淀檢測Bcl-2于PGC-1α是否結(jié)合65-67
• 3.5.1 NIH3T3Bcl-2細(xì)胞中,Bcl-2和PGC-1α的新剪切體結(jié)合65-66
• 3.5.2 U251細(xì)胞中,Bcl-2和PGC-1α的新剪切體結(jié)合66-67
• 3.6 質(zhì)譜檢測未知陽性蛋白為PKM267-69
• 3.7 免疫共沉淀未檢測到Bcl-2與PKM2相互結(jié)合69-70
• 4 討論70-71
• 5. 結(jié)論71-72
• 附錄72-74
• 相關(guān)試劑配方72-74
• 參考文獻74-81
• 碩士學(xué)位期間科研成果81-82
• 致謝82-83

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