【摘要】：蟲媒病毒又稱節(jié)肢動(dòng)物病毒,是指可以在敏感的節(jié)肢動(dòng)物蜱、蚊、曰蛉、(?)等吸血昆蟲體內(nèi)繁殖但不致病,通過吸血昆蟲叮咬將病毒傳播給人畜引起,嚴(yán)重病的一組病毒。蟲媒病毒種類多樣,目前世界上己發(fā)現(xiàn)的蟲媒病毒537種,已證實(shí)其中130余種對(duì)人畜有致病性。我國幅員遼闊,地理環(huán)境復(fù)雜,媒介生物眾多,存在多種蟲媒病毒。另外,隨著國際交往的日益頻繁,境外蟲媒病毒病傳入我國的可能性也顯著增加,因此,高通量、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)蟲媒病毒的感染對(duì)于蟲媒病毒病的防治具有重要的意義。 液相芯片技術(shù)作為一種高通量的檢測(cè)技術(shù),是20世紀(jì)90年代中期由美國(Luminex)公司發(fā)展起來的。該技術(shù)集流式細(xì)胞技術(shù)、熒光編碼微球、激光、奴字信號(hào)處理和傳統(tǒng)的生化技術(shù)于一體,是一種多功能的分析平臺(tái),它可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行定性、定量分析。具有高通量、靈敏度高、重復(fù)性好、節(jié)省樣品的特點(diǎn)。目前,液相芯片技術(shù)在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用主要集中于檢測(cè)病毒核酸或抗體,但對(duì)直接檢測(cè)病毒抗原研究較少。本研究以森林腦炎病毒、日本乙型腦炎病毒、西尼羅熱病毒、東方馬腦炎病毒、辛德比斯病毒、登革熱病毒六種蟲媒病毒為研究對(duì)象,將特異性單克隆抗體偶聯(lián)到不同的熒光微球上,利用免疫學(xué)經(jīng)典方法“雙抗體夾心”的技術(shù)原理,建立能同時(shí)快速檢測(cè)以上六種病毒的液相芯片多重檢測(cè)技術(shù)平臺(tái),為蟲媒病毒的檢測(cè)與鑒定提供一種新方法。 本課題首先制備特異性的單抗。將雜交瘤細(xì)胞免疫小鼠并收集腹水,利用蛋白A/G純化柱進(jìn)行純化。然后,利用雙抗夾心ELISA方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室所保存的病毒特異性單抗進(jìn)行篩選配對(duì),分別篩選出可靈敏檢測(cè)病毒抗原的捕獲抗體和檢測(cè)抗體；進(jìn)而進(jìn)行液相芯片檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化。將捕獲抗體偶聯(lián)熒光羧基后,與病毒滅活抗原共同孵育以特異捕獲病毒抗原,進(jìn)而加入生物素標(biāo)記抗體,孵育后加入SA-PE孵育,利用Luminex200系統(tǒng)檢測(cè)熒光信號(hào)后進(jìn)行結(jié)果分析。在方法建立過程中,本研究對(duì)偶聯(lián)微球及檢測(cè)條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化,進(jìn)而對(duì)該方法的檢測(cè)靈敏度、可重復(fù)性和特異性進(jìn)行了評(píng)估。 通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),摸索出偶聯(lián)微球(106個(gè))的最佳抗體量是20μg。驗(yàn)證液相芯片技術(shù)捕獲抗原、結(jié)合檢測(cè)抗體及SA-PE孵育的-最佳反應(yīng)時(shí)間分別為1.5h、45min、15～30min, SA-PE的最適檢測(cè)用量為1：100。將β巰基乙醇滅活的WNV、 JEV、SINV、EEEV、DENV培養(yǎng)液分別進(jìn)行系列稀釋以摸索該技術(shù)的檢測(cè)靈敏度。結(jié)果顯示,TBEV靈敏度可達(dá)25PFU, WNV、JEV靈敏度可達(dá)195.31PFU。取多種無關(guān)抗原及病原體(BSA、腸道病毒71、黃熱病毒、A型流感病毒、基孔肯亞病毒、呼吸道合胞病毒、西部馬腦炎病毒、B型流感病毒)確定該技術(shù)方法的檢測(cè)特異性,結(jié)果表明,無關(guān)抗原及病原體檢測(cè)孔均未出現(xiàn)陽性信號(hào),表明該檢測(cè)系統(tǒng)具有很好的特異性。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示各個(gè)平均熒光強(qiáng)度值的變異系數(shù)(CV)均在6%以內(nèi),說明該檢測(cè)系統(tǒng)有很好的穩(wěn)定性。通過與傳統(tǒng)-ELISA進(jìn)行比較,結(jié)果顯示液相芯片檢測(cè)六種病毒的靈敏性高于ELISA法,特異性與ELISA結(jié)果一致。 為了確定該檢測(cè)方法對(duì)多種病毒混合感染的檢測(cè)效果,將六種病毒混合后作為擬檢測(cè)抗原,生物素化檢測(cè)抗體的工作溶液為含六種相應(yīng)標(biāo)記抗體的混合物。結(jié)果顯示,六種病毒的偶聯(lián)微球檢測(cè)結(jié)果均出現(xiàn)強(qiáng)的陽性熒光信號(hào),而其它微球檢測(cè)結(jié)果沒有出現(xiàn)陽性信號(hào),微球之間也無交叉反應(yīng),證明該技術(shù)可用于多種病毒混合感染的檢測(cè)。通過多次重復(fù)試驗(yàn),批間變異系數(shù)均小于9%,表明該檢測(cè)方法具有很好的穩(wěn)定性。 蟲媒病毒是一類廣泛存在且危害嚴(yán)重的病毒,目前國內(nèi)外鮮有用液相芯片方法對(duì)蟲媒病毒進(jìn)行檢測(cè)與鑒定的報(bào)道。本研究利用特異性單克隆抗體,采用雙抗夾心方法的原理,建立能對(duì)六種蟲媒病毒進(jìn)行種水平鑒定的液相芯片技術(shù),為蟲媒病毒的檢測(cè)與鑒定提供一種高通量的新方法,用于早期快速確定病原體。對(duì)于臨床救治、流行病學(xué)調(diào)查都將具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2521275