本文關(guān)鍵詞：一、B型鏈球菌毒力因子的初步晶體學(xué)研究 二、免疫卡控點(diǎn)TIGIT抗原表位和抗體CDR序列的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：1.B型鏈球菌毒力因子的初步晶體學(xué)研究B型鏈球菌(GBS)是導(dǎo)致圍產(chǎn)期和新生兒感染的主要病原菌,主要存在于大約25%健康女性的生殖道中。GBS在子宮內(nèi)的上行感染增加了新生兒患肺炎,敗血癥,腦膜炎的風(fēng)險(xiǎn)。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于GBS的預(yù)防方案采用的主要是抗生素預(yù)防,但是近些年出現(xiàn)的GBS對(duì)抗生素的耐受性引起了對(duì)GBS感染治療的關(guān)注。目前還沒有有效的措施預(yù)防GBS的上行感染,因此新型疫苗和抗菌藥物的開發(fā)已經(jīng)迫在眉睫,而針對(duì)GBS毒力蛋白或其合成途徑設(shè)計(jì)抑制性藥物是一種較為有效且可行的方案。GBS基因組測(cè)序已經(jīng)完成,結(jié)合文獻(xiàn)的報(bào)道,我們篩選了十種與GBS毒力作用相關(guān)的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究,這十種蛋白包括負(fù)責(zé)合成GBSβ-haemolysis的cyl操縱子上的cylA、cylB和cylE,還有一些與GBS毒性相關(guān)的表面蛋白,這些表面蛋白對(duì)GBS的生長(zhǎng)和毒性具有不可或缺的作用。我們?cè)噲D利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段探究這些蛋白發(fā)揮毒力作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),希望通過結(jié)構(gòu)分析找到這些蛋白上的潛在靶向藥物作用位點(diǎn),為新型抗菌藥物的開發(fā)與設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。于是,我們將這十種毒力蛋白分別進(jìn)行了分子克隆、大量表達(dá)與純化,并對(duì)純化得到的高純度蛋白進(jìn)行大規(guī)模的晶體篩選。最后,有兩種表面蛋白收集了衍射數(shù)據(jù),通過對(duì)衍射數(shù)據(jù)的處理獲得了初步的結(jié)構(gòu)信息。2.免疫卡控點(diǎn)TIGIT抗原表位和抗體CDR序列的初步研究近年來,針對(duì)免疫細(xì)胞共抑制性受體的免疫卡控點(diǎn)治療在腫瘤免疫治療中取得了巨大進(jìn)展。免疫卡控點(diǎn)治療與傳統(tǒng)治療方法的區(qū)別在于,它不是以腫瘤細(xì)胞作為靶點(diǎn),而是以免疫細(xì)胞表面的抑制性受體為靶點(diǎn),通過抑制這種受體來激活免疫細(xì)胞抗腫瘤活性,研究最多的這種抑制性受體是CTLA4,PD-1,目前針對(duì)它們的單抗藥物已經(jīng)在臨床實(shí)驗(yàn)中取得了初步成功。但是這些抗體藥物還具有局限性和副作用,所以發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證新的共抑制性受體成為一個(gè)全球競(jìng)爭(zhēng)性的熱點(diǎn)。TIGIT是2009年被發(fā)現(xiàn)的位于NK細(xì)胞和T細(xì)胞表面的共抑制性受體,目前研究表明阻斷TIGIT的單克隆抗體,在動(dòng)物模型中具有很好的抗癌效果,所以TIGIT是一個(gè)很具潛力的免疫治療新靶點(diǎn),但國(guó)內(nèi)外還沒有針對(duì)TIGIT受體的抗體藥物上市,因此亟須開展高效特異性TIGIT單克隆抗體的研發(fā)。該研究課題主要圍繞TIGIT單克隆抗體與TIGIT復(fù)合物結(jié)構(gòu)展開,希望能通過解析復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)來發(fā)現(xiàn)TIGIT單抗高變識(shí)別區(qū)(CDR)序列和TIGIT靶點(diǎn)的抗原表位,然后再基于結(jié)構(gòu)改造獲得更高親和力的TIGIT單抗序列。在本課題中,我們構(gòu)建了鼠和人TIGIT的原核表達(dá)體系,對(duì)TIGIT進(jìn)行了表達(dá)和純化；從裸鼠腹水中純化TIGIT單抗,并構(gòu)建了抗體Fab段的原核分泌型表達(dá)體系,進(jìn)行原核純化。
【關(guān)鍵詞】：B型鏈球菌 cylA cy1B cylE 表面蛋白 毒力因子 免疫卡控點(diǎn) TIGIT 單克隆抗體 抗原表位 高變識(shí)別區(qū)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378.12
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一部分 GBS毒力因子的初步晶體學(xué)研究12-58
• 第一章 緒論12-20
• 1.1 引言12-14
• 1.1.1 B型鏈球菌概述12-13
• 1.1.2 GBS毒力機(jī)制及毒力因子概述13-14
• 1.2 β-haemolysin/cytolysin14-17
• 1.2.1 β-haemolysin/cytolysin概述14-15
• 1.2.2 cyl操縱子15-17
• 1.3 GBS pigment17-19
• 1.3.1 GBS pigment研究進(jìn)展17-18
• 1.3.2 GBS pigment毒力機(jī)制18-19
• 1.4 研究目的與研究意義19-20
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法20-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備20-21
• 2.1.1 菌株和載體20
• 2.1.2 酶與其它試劑20
• 2.1.3 儀器設(shè)備20-21
• 2.2 生物信息學(xué)分析21
• 2.3 B型鏈球菌相關(guān)毒力因子的基因克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建21-29
• 2.3.1 引物設(shè)計(jì)21-22
• 2.3.2 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物回收22-23
• 2.3.3 雙酶切法構(gòu)建重組質(zhì)粒23-25
• 2.3.4 Gibson assembly法構(gòu)建重組質(zhì)粒25-26
• 2.3.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α26-28
• 2.3.6 陽(yáng)性克隆的篩選鑒定及質(zhì)粒抽提28-29
• 2.4 GBS毒力因子的表達(dá)與純化29-35
• 2.4.1 目的蛋白的表達(dá)檢測(cè)與鑒定29-31
• 2.4.2 目的蛋白的大量表達(dá)31-33
• 2.4.3 目的蛋白的分離與純化33-35
• 2.4.4 濃縮、蛋白濃度測(cè)定35
• 2.5 晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)方法解析蛋白三維結(jié)構(gòu)35-40
• 2.5.1 蛋白結(jié)晶篩選35-37
• 2.5.2 晶體凍存37-38
• 2.5.3 衍射數(shù)據(jù)的收集38-39
• 2.5.4 衍射數(shù)據(jù)的處理39-40
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論40-55
• 3.1 GBS毒力因子的質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)檢測(cè)結(jié)果40
• 3.2 GBS毒力因子的純化40-49
• 3.2.1 cylA蛋白的純化結(jié)果40-43
• 3.2.2 Maltose binding protein的純化43-44
• 3.2.3 SeMet-maltose binding protein的純化44-45
• 3.2.4 Oligopeptide binding protein的純化45-46
• 3.2.5 SeMet-Oligopeptide binding protein的純化46-47
• 3.2.6 Surface immunogenic protein的純化47-48
• 3.2.7 Putative pathogenicity protein的純化48-49
• 3.3 蛋白晶體的生長(zhǎng)49-52
• 3.3.1 Maltose binding protein晶體篩選與優(yōu)化49-50
• 3.3.2 Oligopeptide binding protein晶體初篩與優(yōu)化50-51
• 3.3.3 SeMet-Oligopeptide binding protein的初篩與優(yōu)化51-52
• 3.4 衍射數(shù)據(jù)的收集與處理52-55
• 3.4.1 Maltose binding protein數(shù)據(jù)的收集與處理52-53
• 3.4.2 Oligopeptide binding Protein的數(shù)據(jù)收集與處理53-55
• 本篇小結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-58
• 第二篇 免疫卡控點(diǎn)TIGIT抗原表位和抗體CDR序列的研究(合作項(xiàng)目)58-83
• 第四章 研究背景58-65
• 4.1 免疫卡控點(diǎn)治療58-60
• 4.1.1 免疫卡控點(diǎn)CTLA-4和PD158-59
• 4.1.2 基于CTLA-和PD1的免疫治療59-60
• 4.2 新型免疫細(xì)胞表面抑制性受體TIGIT60-62
• 4.2.1 TIGIT研究背景介紹60-61
• 4.2.2 TIGIT是極具潛力的免疫治療的新靶點(diǎn)61-62
• 4.3 TIGIT和CD226結(jié)構(gòu)研究狀況62-64
• 4.4 研究目的與研究意義64-65
• 第五章 實(shí)驗(yàn)方法65-72
• 5.1 生物信息學(xué)獲取65
• 5.2 TIGIT與CD226分子克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建65-66
• 5.3 TIGIT與CD226蛋白的表達(dá)檢測(cè)與大規(guī)模培養(yǎng)66
• 5.4 重組蛋白的表達(dá)與純化66-70
• 5.4.1 mTIGIT IgV的表達(dá)純化66-70
• 5.4.2 hTIGIT蛋白的表達(dá)純化70
• 5.5 mTIGIT單克隆抗體的純化70-72
• 第六章 結(jié)果與討論72-80
• 6.1 mTIGIT蛋白的結(jié)果分析72-76
• 6.1.1 mTIGIT氨基酸序列的生物信息學(xué)分析72-73
• 6.1.2 mTIGIT基因的分子克隆與質(zhì)粒構(gòu)建73
• 6.1.3 mTIGIT蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果73-74
• 6.1.4 mTIGIT的純化結(jié)果74-75
• 6.1.5 mTIGIT的質(zhì)譜鑒定結(jié)果75-76
• 6.2 hTIGIT蛋白的結(jié)果分析76-78
• 6.2.1 hTIGIT的分子克隆與質(zhì)粒構(gòu)建76
• 6.2.2 hTIGIT基因的表達(dá)檢測(cè)76-77
• 6.2.3 hTIGIT蛋白的純化結(jié)果77-78
• 6.3 mTIGIT單克隆抗體的純化結(jié)果78-80
• 本篇小結(jié)80-81
• 參考文獻(xiàn)81-83
• 附錄83-86
• 致謝86

  本文關(guān)鍵詞：一、B型鏈球菌毒力因子的初步晶體學(xué)研究 二、免疫卡控點(diǎn)TIGIT抗原表位和抗體CDR序列的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：251930