本文關(guān)鍵詞：一、B型鏈球菌毒力因子的初步晶體學(xué)研究 二、免疫卡控點TIGIT抗原表位和抗體CDR序列的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：1.B型鏈球菌毒力因子的初步晶體學(xué)研究B型鏈球菌(GBS)是導(dǎo)致圍產(chǎn)期和新生兒感染的主要病原菌,主要存在于大約25%健康女性的生殖道中。GBS在子宮內(nèi)的上行感染增加了新生兒患肺炎,敗血癥,腦膜炎的風(fēng)險。目前,國內(nèi)外對于GBS的預(yù)防方案采用的主要是抗生素預(yù)防,但是近些年出現(xiàn)的GBS對抗生素的耐受性引起了對GBS感染治療的關(guān)注。目前還沒有有效的措施預(yù)防GBS的上行感染,因此新型疫苗和抗菌藥物的開發(fā)已經(jīng)迫在眉睫,而針對GBS毒力蛋白或其合成途徑設(shè)計抑制性藥物是一種較為有效且可行的方案。GBS基因組測序已經(jīng)完成,結(jié)合文獻的報道,我們篩選了十種與GBS毒力作用相關(guān)的蛋白進行結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究,這十種蛋白包括負責合成GBSβ-haemolysis的cyl操縱子上的cylA、cylB和cylE,還有一些與GBS毒性相關(guān)的表面蛋白,這些表面蛋白對GBS的生長和毒性具有不可或缺的作用。我們試圖利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段探究這些蛋白發(fā)揮毒力作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),希望通過結(jié)構(gòu)分析找到這些蛋白上的潛在靶向藥物作用位點,為新型抗菌藥物的開發(fā)與設(shè)計提供理論依據(jù)。于是,我們將這十種毒力蛋白分別進行了分子克隆、大量表達與純化,并對純化得到的高純度蛋白進行大規(guī)模的晶體篩選。最后,有兩種表面蛋白收集了衍射數(shù)據(jù),通過對衍射數(shù)據(jù)的處理獲得了初步的結(jié)構(gòu)信息。2.免疫卡控點TIGIT抗原表位和抗體CDR序列的初步研究近年來,針對免疫細胞共抑制性受體的免疫卡控點治療在腫瘤免疫治療中取得了巨大進展。免疫卡控點治療與傳統(tǒng)治療方法的區(qū)別在于,它不是以腫瘤細胞作為靶點,而是以免疫細胞表面的抑制性受體為靶點,通過抑制這種受體來激活免疫細胞抗腫瘤活性,研究最多的這種抑制性受體是CTLA4,PD-1,目前針對它們的單抗藥物已經(jīng)在臨床實驗中取得了初步成功。但是這些抗體藥物還具有局限性和副作用,所以發(fā)現(xiàn)和驗證新的共抑制性受體成為一個全球競爭性的熱點。TIGIT是2009年被發(fā)現(xiàn)的位于NK細胞和T細胞表面的共抑制性受體,目前研究表明阻斷TIGIT的單克隆抗體,在動物模型中具有很好的抗癌效果,所以TIGIT是一個很具潛力的免疫治療新靶點,但國內(nèi)外還沒有針對TIGIT受體的抗體藥物上市,因此亟須開展高效特異性TIGIT單克隆抗體的研發(fā)。該研究課題主要圍繞TIGIT單克隆抗體與TIGIT復(fù)合物結(jié)構(gòu)展開,希望能通過解析復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)來發(fā)現(xiàn)TIGIT單抗高變識別區(qū)(CDR)序列和TIGIT靶點的抗原表位,然后再基于結(jié)構(gòu)改造獲得更高親和力的TIGIT單抗序列。在本課題中,我們構(gòu)建了鼠和人TIGIT的原核表達體系,對TIGIT進行了表達和純化；從裸鼠腹水中純化TIGIT單抗,并構(gòu)建了抗體Fab段的原核分泌型表達體系,進行原核純化。
【關(guān)鍵詞】：B型鏈球菌 cylA cy1B cylE 表面蛋白 毒力因子 免疫卡控點 TIGIT 單克隆抗體 抗原表位 高變識別區(qū)
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378.12
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一部分 GBS毒力因子的初步晶體學(xué)研究12-58
• 第一章 緒論12-20
• 1.1 引言12-14
• 1.1.1 B型鏈球菌概述12-13
• 1.1.2 GBS毒力機制及毒力因子概述13-14
• 1.2 β-haemolysin/cytolysin14-17
• 1.2.1 β-haemolysin/cytolysin概述14-15
• 1.2.2 cyl操縱子15-17
• 1.3 GBS pigment17-19
• 1.3.1 GBS pigment研究進展17-18
• 1.3.2 GBS pigment毒力機制18-19
• 1.4 研究目的與研究意義19-20
• 第二章 實驗材料與方法20-40
• 2.1 實驗材料與儀器設(shè)備20-21
• 2.1.1 菌株和載體20
• 2.1.2 酶與其它試劑20
• 2.1.3 儀器設(shè)備20-21
• 2.2 生物信息學(xué)分析21
• 2.3 B型鏈球菌相關(guān)毒力因子的基因克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建21-29
• 2.3.1 引物設(shè)計21-22
• 2.3.2 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物回收22-23
• 2.3.3 雙酶切法構(gòu)建重組質(zhì)粒23-25
• 2.3.4 Gibson assembly法構(gòu)建重組質(zhì)粒25-26
• 2.3.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α26-28
• 2.3.6 陽性克隆的篩選鑒定及質(zhì)粒抽提28-29
• 2.4 GBS毒力因子的表達與純化29-35
• 2.4.1 目的蛋白的表達檢測與鑒定29-31
• 2.4.2 目的蛋白的大量表達31-33
• 2.4.3 目的蛋白的分離與純化33-35
• 2.4.4 濃縮、蛋白濃度測定35
• 2.5 晶體學(xué)實驗方法解析蛋白三維結(jié)構(gòu)35-40
• 2.5.1 蛋白結(jié)晶篩選35-37
• 2.5.2 晶體凍存37-38
• 2.5.3 衍射數(shù)據(jù)的收集38-39
• 2.5.4 衍射數(shù)據(jù)的處理39-40
• 第三章 實驗結(jié)果與討論40-55
• 3.1 GBS毒力因子的質(zhì)粒構(gòu)建與表達檢測結(jié)果40
• 3.2 GBS毒力因子的純化40-49
• 3.2.1 cylA蛋白的純化結(jié)果40-43
• 3.2.2 Maltose binding protein的純化43-44
• 3.2.3 SeMet-maltose binding protein的純化44-45
• 3.2.4 Oligopeptide binding protein的純化45-46
• 3.2.5 SeMet-Oligopeptide binding protein的純化46-47
• 3.2.6 Surface immunogenic protein的純化47-48
• 3.2.7 Putative pathogenicity protein的純化48-49
• 3.3 蛋白晶體的生長49-52
• 3.3.1 Maltose binding protein晶體篩選與優(yōu)化49-50
• 3.3.2 Oligopeptide binding protein晶體初篩與優(yōu)化50-51
• 3.3.3 SeMet-Oligopeptide binding protein的初篩與優(yōu)化51-52
• 3.4 衍射數(shù)據(jù)的收集與處理52-55
• 3.4.1 Maltose binding protein數(shù)據(jù)的收集與處理52-53
• 3.4.2 Oligopeptide binding Protein的數(shù)據(jù)收集與處理53-55
• 本篇小結(jié)55-56
• 參考文獻56-58
• 第二篇 免疫卡控點TIGIT抗原表位和抗體CDR序列的研究(合作項目)58-83
• 第四章 研究背景58-65
• 4.1 免疫卡控點治療58-60
• 4.1.1 免疫卡控點CTLA-4和PD158-59
• 4.1.2 基于CTLA-和PD1的免疫治療59-60
• 4.2 新型免疫細胞表面抑制性受體TIGIT60-62
• 4.2.1 TIGIT研究背景介紹60-61
• 4.2.2 TIGIT是極具潛力的免疫治療的新靶點61-62
• 4.3 TIGIT和CD226結(jié)構(gòu)研究狀況62-64
• 4.4 研究目的與研究意義64-65
• 第五章 實驗方法65-72
• 5.1 生物信息學(xué)獲取65
• 5.2 TIGIT與CD226分子克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建65-66
• 5.3 TIGIT與CD226蛋白的表達檢測與大規(guī)模培養(yǎng)66
• 5.4 重組蛋白的表達與純化66-70
• 5.4.1 mTIGIT IgV的表達純化66-70
• 5.4.2 hTIGIT蛋白的表達純化70
• 5.5 mTIGIT單克隆抗體的純化70-72
• 第六章 結(jié)果與討論72-80
• 6.1 mTIGIT蛋白的結(jié)果分析72-76
• 6.1.1 mTIGIT氨基酸序列的生物信息學(xué)分析72-73
• 6.1.2 mTIGIT基因的分子克隆與質(zhì)粒構(gòu)建73
• 6.1.3 mTIGIT蛋白表達檢測結(jié)果73-74
• 6.1.4 mTIGIT的純化結(jié)果74-75
• 6.1.5 mTIGIT的質(zhì)譜鑒定結(jié)果75-76
• 6.2 hTIGIT蛋白的結(jié)果分析76-78
• 6.2.1 hTIGIT的分子克隆與質(zhì)粒構(gòu)建76
• 6.2.2 hTIGIT基因的表達檢測76-77
• 6.2.3 hTIGIT蛋白的純化結(jié)果77-78
• 6.3 mTIGIT單克隆抗體的純化結(jié)果78-80
• 本篇小結(jié)80-81
• 參考文獻81-83
• 附錄83-86
• 致謝86

  本文關(guān)鍵詞：一、B型鏈球菌毒力因子的初步晶體學(xué)研究 二、免疫卡控點TIGIT抗原表位和抗體CDR序列的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：251930