發(fā)布時(shí)間：2019-07-22 16:46

【摘要】：波長(zhǎng)為280-320nm的UVB是紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生光損傷反應(yīng)的關(guān)鍵致傷因素。UVB除了能在基因水平誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)之外,細(xì)胞中一系列炎性因子的分泌和表達(dá)也是UVB誘導(dǎo)細(xì)胞損傷反應(yīng)的重要介導(dǎo)因素。其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)由于具有促進(jìn)血管發(fā)生、增加血管通透性、促進(jìn)脈管生成等作用,因此在過(guò)度UVB暴露引發(fā)的以皮膚紅斑、水腫、脫皮等為主要特征的急性光損傷反應(yīng)以及以皮膚衰老進(jìn)程加快、皮膚癌發(fā)生和發(fā)展等為主要特征的慢性光損傷反應(yīng)中具有重要的作用。盡管目前人們對(duì)UVB如何實(shí)現(xiàn)VEGF誘導(dǎo)表達(dá)的胞內(nèi)分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)還十分有限,但拮抗VEGF的表達(dá)上調(diào)能夠顯著抑制皮膚組織對(duì)UVB的光損傷反應(yīng)敏感性。因此,揭示UVB誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和分子機(jī)制在防治UVB引發(fā)的一系列急、慢性光損傷反應(yīng)中具有重要的科學(xué)意義和醫(yī)學(xué)價(jià)值。 本論文主要研究UVB刺激作用下,小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts ,MEFs)中VEGF誘導(dǎo)表達(dá)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。目前,有關(guān)UVB反應(yīng)中VEGF誘導(dǎo)表達(dá)理論分為直接型和間接型兩種。所謂直接型指UVB刺激通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子的作用直接引起VEGF表達(dá)上調(diào);間接型指在UVB刺激作用下,通過(guò)TNFα介導(dǎo)VEGF的表達(dá),但這一過(guò)程中似乎并不涉及TNFα與其受體的結(jié)合。下面我們分別對(duì)這兩種理論進(jìn)行探討。 在第一部分研究中發(fā)現(xiàn),UVB能夠上調(diào)MEFs細(xì)胞中vegf基因啟動(dòng)子活性、并在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平實(shí)現(xiàn)對(duì)VEGF的誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)我們確定了IKK激酶的催化亞基IKKα在這一過(guò)程中的關(guān)鍵作用,并且IKKα可不依賴于IKKα和NF-αB獨(dú)立介導(dǎo)UVB誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)。隨后,通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)小鼠vegf啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)vegf啟動(dòng)子區(qū)存在3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子AP-1的潛在結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),AP-1正是位于IKKα下游參與UVB誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的關(guān)鍵蛋白分子,并且c-Jun和c-Fos是組成UVB誘導(dǎo)活化的AP-1的重要功能亞基,此過(guò)程不涉及在腫瘤細(xì)胞VEGF誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中具有重要作用的HIF1α的參與。由于IKKα與AP-1均在UVB誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的過(guò)程中發(fā)揮作用,因此,我們進(jìn)一步探討了IKKα與AP-1之間可能存在的功能聯(lián)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),IKKα的存在是實(shí)現(xiàn)UVB刺激作用下c-Fos誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因素,c-Fos能與c-Jun形成AP-1異源二聚體并結(jié)合于vegf啟動(dòng)子區(qū)域的AP-1結(jié)合位點(diǎn),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)VEGF誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控作用。以上結(jié)果確定了IKKα/c-Fos/AP-1信號(hào)通路在介導(dǎo)UVB誘導(dǎo)VEGF表達(dá)過(guò)程中的重要作用。 根據(jù)目前最新的研究線索,IKKα與IKKα在發(fā)揮功能效應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵區(qū)別在于IKKα具有組成性的核定位功能,它能夠直接結(jié)合于NF-αB靶基因啟動(dòng)子區(qū)域并通過(guò)催化組蛋白的磷酸化反應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)NF-αB靶基因誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控作用。那么在UVB誘導(dǎo)VEGF表達(dá)過(guò)程中是否涉及IKKα的這種類似功能模式呢α我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),UVB能有效誘導(dǎo)核內(nèi)IKKα活化,同時(shí)活化型IKKα能與共定位于細(xì)胞核的c-Fos發(fā)生相互作用。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn),我們分析了IKKα能否結(jié)合于vegf啟動(dòng)子區(qū)域。結(jié)果顯示,UVB刺激作用下,IKKα和c-Fos均能夠結(jié)合于vegf啟動(dòng)子區(qū)域的3個(gè)潛在的AP-1結(jié)合位點(diǎn)。而這種染色質(zhì)DNA結(jié)合能力正是IKKα發(fā)揮核激酶功能的關(guān)鍵前提。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),IKKα能夠通過(guò)催化vegf啟動(dòng)子上AP-1結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域的組蛋白H3發(fā)生磷酸化修飾反應(yīng),從而上調(diào)UVB刺激作用下VEGF的誘導(dǎo)表達(dá)水平,發(fā)揮協(xié)同基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。此部分研究結(jié)果揭示了IKKα參與UVB反應(yīng)中VEGF誘導(dǎo)表達(dá)的新途徑。這不僅為IKK/NF-κB信號(hào)通路的基礎(chǔ)理論研究提供了創(chuàng)新性的研究發(fā)現(xiàn),同時(shí),也首次揭示了IKKα不依賴于IKKα獨(dú)立介導(dǎo)細(xì)胞炎性損傷效應(yīng)的新模式。 p85α是組成PI-3K蛋白激酶中一種重要的調(diào)節(jié)亞基。由于各種細(xì)胞中p85α表達(dá)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)PI-3K催化亞基p110,因此p85α除了能與p110形成異源二聚體而發(fā)揮PI-3K激酶活性以外,單體型p85α也被推斷具有獨(dú)立的生物學(xué)功能。本課題組在以往的研究中發(fā)現(xiàn):p85α可不依賴于PI-3K激酶活性通過(guò)激活NFAT-TNFα信號(hào)通路介導(dǎo)UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)。那么由p85α介導(dǎo)產(chǎn)生的TNFα是否能夠通過(guò)間接機(jī)制參與VEGF的誘導(dǎo)表達(dá)呢α因此,在第二部分研究中,我們對(duì)以上假設(shè)進(jìn)行了探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn),p85α能介導(dǎo)UVB刺激作用下VEGF的誘導(dǎo)表達(dá),轉(zhuǎn)錄因子NFAT3是p85α介導(dǎo)這一過(guò)程中的下游關(guān)鍵信號(hào)分子,TNFα的誘導(dǎo)表達(dá)也參與了UVB刺激作用下VEGF的表達(dá)。以上結(jié)果表明,VEGF在UVB刺激作用下也能夠通過(guò)p85α/NFAT/TNFα信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)。本部分研究結(jié)果初步揭示了單體型p85α在細(xì)胞炎性損傷效應(yīng)中的作用機(jī)制,使單體型p85α的效應(yīng)機(jī)制研究首次從細(xì)胞生存與凋亡調(diào)控?cái)U(kuò)展到炎性反應(yīng)。綜上所述,本論文研究結(jié)果揭示了UVB誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的兩條新型胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,同時(shí)闡明了IKKα和p85α這兩種重要的信號(hào)蛋白分子在VEGF誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中的新模式。以上研究結(jié)果為與VEGF相關(guān)的紫外線損傷防御策略提供了新的依據(jù)和思路。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2517754