【摘要】：第一部分：SD大鼠光損模型的建立及觀察 本部分研究選用成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,體重180-210克(g)。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均在12小時(shí)(h)明(30～50Lux)及12h暗(0～10Lux)循環(huán)光環(huán)境下適應(yīng)7天(d)后,予以縫線開瞼,1%阿托品擴(kuò)瞳。經(jīng)24h暗適應(yīng)(0～10Lux),放入光照箱中接受24h強(qiáng)度為2500Lux的寬譜藍(lán)光(波長400～440nm)照射,溫度控制在22-25攝氏度(℃)。光照結(jié)束后再次置于黑暗(0～10Lux)環(huán)境下適應(yīng)24h,后恢復(fù)12h明以及12暗循環(huán)光環(huán)境。在光照后即刻(0h)、2h、6h、1天(d)、3d、7d、及14d時(shí)取大鼠視網(wǎng)膜切片,行蘇木素-尹紅(H-E)染色及TUNEL染色觀察實(shí)驗(yàn)大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的改變及細(xì)胞凋亡的情況。 結(jié)果顯示：正常SD大鼠視網(wǎng)膜切片見各層層次清晰,由內(nèi)向外依次可見3層界限分明的核層,由蘇木素著染呈藍(lán)紫色。最內(nèi)層為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核層(GCL),由一至二層細(xì)胞核,較大,可見核仁,其內(nèi)為視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(NFL)；中間層為內(nèi)核層(INL),多層細(xì)胞核,比GCL層小,排列較外核層(ONL)略稀疏；最外層為ONL,細(xì)胞層次最多且最密集,核小且深染。感光細(xì)胞內(nèi)/外節(jié)(IS/OS層)層位于ONL之外,尹紅著染呈紅色,排列整齊,內(nèi)/外節(jié)間見少量間隙。光照主要損傷外層視網(wǎng)膜,尤其是ONL和IS/OS層。光鏡下觀察,視網(wǎng)膜損傷性改變最早出現(xiàn)于光損傷后6h,見IS/OS腫脹,排列紊亂,此時(shí)ONL無明顯改變；光損傷后1d,IS/OS層破壞,見ONL細(xì)胞核排列紊亂而厚度尚未變化；光損傷后3d,IS/OS層幾乎消失,ONL細(xì)胞核顯著減少,核質(zhì)固縮,厚度明顯變薄,提示光感受器大量丟失；光損傷后7天,ONL進(jìn)一步變薄,細(xì)胞核丟失；光損傷后14d時(shí)ONL僅剩余一至二層細(xì)胞核,視網(wǎng)膜顯著變薄。光照主要通過細(xì)胞凋亡的途徑損傷ONL。正常大鼠視網(wǎng)膜切片呈TUNEL(-)；光損傷后2h,于ONL出現(xiàn)TUNEL(+)細(xì)胞,INL和GCL呈TUNEL(-)；光損傷后1d,ONL中TUNEL(+)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高峰,陽性細(xì)胞核皺縮,染色質(zhì)凝聚成致密的塊狀,多聚集于核膜下,呈現(xiàn)“新月形”及“環(huán)形”等染色質(zhì)邊集的典型細(xì)胞凋亡特征；光損傷后3d,ONL的TUNEL(+)細(xì)胞數(shù)量開始減少,伴隨ONL細(xì)胞數(shù)量顯著減少；光損傷后14d,ONL細(xì)胞幾近消失,僅存一至二層,TUNEL(-)。由此可見,光照主要通過凋亡的方式損傷大鼠ONL,ONL細(xì)胞凋亡先于細(xì)胞數(shù)量的減少。 第二部分：SD大鼠光損模型中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化、遷移及抗原呈遞功能的變化 光損傷后2h、6h、1d、3d、7d、14d,采用免疫熒光染色觀察SD大鼠視網(wǎng)膜OX42(+)細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞)的形態(tài)和遷移；觀察小膠質(zhì)細(xì)胞主要組織相容性分子Ⅱ(MHC-Ⅱ)及其上游分子CIITA的表達(dá)。 結(jié)果顯示：正常SD大鼠視網(wǎng)膜切片中可見少量OX42(+)細(xì)胞,主要位于NFL和內(nèi)叢狀層(IPL)內(nèi),細(xì)胞多突起,呈細(xì)分枝狀,ONL或視網(wǎng)膜下均呈OX42(-)；光損傷后即刻,OX42(+)細(xì)胞開始出現(xiàn)在ONL,細(xì)胞形態(tài)多樣,仍有突起,但較正常時(shí)突起減少,且更粗大；隨后視網(wǎng)膜外層OX42(+)細(xì)胞迅速增加,隨時(shí)間逐漸向外層移動(dòng)；光損傷后3d,OX42(+)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高峰,主要位于IS/OS層和視網(wǎng)膜下,細(xì)胞邊界圓潤光滑,呈阿米巴樣外觀,細(xì)胞突起顯著減少。正常SD大鼠視網(wǎng)膜切片中MHC-Ⅱ(+)細(xì)胞很少,偶見位于NFL的單個(gè)MHC-Ⅱ(+)細(xì)胞；直至光損傷后3d,可于IS/OS層和視網(wǎng)膜下見部分MHC-Ⅱ(+)細(xì)胞；此后逐漸減少,至光損傷后7d,MHC-Ⅱ(+)細(xì)胞基本消失。作為MHC-Ⅱ的上游分子,CIITA具有相似的表達(dá)情況。 第三部分：感光細(xì)胞間維生素A類結(jié)合蛋白(IRBP)R16多肽免疫治療對光損傷模型中光感受器的保護(hù)作用 本部分研究實(shí)驗(yàn)大鼠分為IRBPR16治療組、PBS對照組和空白對照組。IRBPR16治療組注射IRBPR16多肽進(jìn)行免疫干預(yù)后建立光損傷模型,PBS對照組注射PBS后建立模型,而空白對照組不做任何處理,直接進(jìn)行光照。 結(jié)果顯示：PBS對照組表現(xiàn)為光損傷后6h見視網(wǎng)膜IS/OS腫脹,但ONL細(xì)胞層次無明顯改變；光損傷后1d,IS/OS破壞,ONL細(xì)胞核排列紊亂,但此時(shí)ONL厚度未見明顯改變；光損傷后3d,IS/OS幾乎消失,ONL層次顯著減少；光損傷后7天,ONL細(xì)胞核數(shù)量進(jìn)一步減少；至光損傷后14d時(shí)ONL僅剩余一至二層細(xì)胞核,視網(wǎng)膜顯著變薄。這與空白對照組視網(wǎng)膜外層改變無明顯區(qū)別。相比PBS對照組和空白對照組,IRBPR16治療組光損傷3d后ONL厚度顯著提高,此時(shí)的ONL厚度與光損傷后3d時(shí)無顯著差別,提示IRBPR16多肽免疫治療對光感受器的保護(hù)作用。另一方面,PBS對照組ONL細(xì)胞凋亡情況也與空白對照組一致,表現(xiàn)為光損傷后2h,ONL出現(xiàn)TUNEL(+)細(xì)胞；光損傷后1d,TUNEL(+)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高峰,顯示出典型凋亡改變；光損傷后3d,TUNEL(+)細(xì)胞數(shù)量減少,伴隨ONL細(xì)胞數(shù)量減少；光損傷后14d,ONL細(xì)胞幾近消失,僅存一至二層,此時(shí)TUNEL(+)細(xì)胞不能檢出。而IRBPR16治療組在光損傷后2h時(shí)ONL開始出現(xiàn)TUNEL(+)細(xì)胞,1d后TUNEL(+)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰,但其數(shù)量明顯少于另兩組,此后TUNEL(+)細(xì)胞逐漸減少,至光損傷后7d未見凋亡細(xì)胞,但可見ONL細(xì)胞數(shù)量顯著多于另兩組。 第四部分：IRBPR16多肽免疫治療上調(diào)SD大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞抗原呈遞相關(guān)分子的表達(dá) 三組大鼠光損傷后各時(shí)點(diǎn)采用免疫熒光染色比較不同組大鼠視網(wǎng)膜OX42(十)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和遷移；比較不同組間小膠質(zhì)細(xì)胞主要組織相容性分子Ⅱ(MHC-Ⅱ分子)及其上游分子CIITA表達(dá)的差異；采用Western Blot方法定量比較不同組間視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞抗原呈遞分子表達(dá)的差異。 結(jié)果顯示：PBS對照組表現(xiàn)為光損傷后即刻(0h),ONL開始出現(xiàn)OX42(+)細(xì)胞；之后OX42(+)細(xì)胞數(shù)量增加,并逐漸向外層移動(dòng)；光損傷后3d,OX42(+)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高峰,主要位于IS/OS層和視網(wǎng)膜下腔,細(xì)胞呈阿米巴樣外觀。這與IRBPR16治療組和空白對照組視網(wǎng)膜內(nèi)OX42(+)細(xì)胞各核層細(xì)胞的數(shù)量和位置變化無明顯區(qū)別,提示足墊內(nèi)注射IRBPR16+弗氏佐劑或PBS+弗氏佐劑均對光損傷時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化能力不產(chǎn)生影響。另一方面,PBS對照組在小膠質(zhì)細(xì)胞抗原呈遞分子MHC-Ⅱ和其上游分子CIITA的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量上與空白對照組沒有區(qū)別,表現(xiàn)為光損傷后3d,可于IS/OS層和視網(wǎng)膜下見部分MHC-Ⅱ(+)和CIITA(+)細(xì)胞；此后逐漸減少,至光損傷后14d,MHC-Ⅱ(+)和CⅡTA(+)細(xì)胞基本消失。在IRBPR16對照組大鼠視網(wǎng)膜中,可見MHC-Ⅱ(+)細(xì)胞早在光損傷后1d即在視網(wǎng)膜外層大量出現(xiàn),其數(shù)量和表達(dá)強(qiáng)度與光損傷后3d沒有區(qū)別。Western Blot結(jié)果也證實(shí),相比PBS對照組和空白對照組,IRBPR16治療組視網(wǎng)膜MHC-Ⅱ和CIITA的表達(dá)升高更早,而且表達(dá)量更高,提示視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞抗原呈遞功能增強(qiáng)。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王麗虹,程化坤;小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫功能[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2005年01期

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本文編號(hào)：2517461