【摘要】：傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,成人神經(jīng)細(xì)胞損傷后無(wú)法再生,功能無(wú)法重建,以致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及變性疾病患者的神經(jīng)功能很難恢復(fù)。近年研究發(fā)現(xiàn),在胚胎期和成年期哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中存在具有自我增殖、自我更新和多向分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs),神經(jīng)干細(xì)胞由胚胎早期的神經(jīng)上皮細(xì)胞產(chǎn)生,能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞,神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)不能再生的傳統(tǒng)理論提出了挑戰(zhàn),為研究神經(jīng)細(xì)胞的再生和功能重建帶來(lái)了新前景。然而,自然情況下,神經(jīng)干細(xì)胞大部分分化為膠質(zhì)細(xì)胞,僅少量分化為神經(jīng)元,目前尚無(wú)法有效控制神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為特定的神經(jīng)細(xì)胞,因此,如何調(diào)控NSCs定向分化為功能性神經(jīng)元成為神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。心脈隆注射液(xinmailong injection, XML)是從昆蟲(chóng)美洲大蠊體內(nèi)提取的核苷類化合物,有實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,美洲大蠊提取物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、促血管增生和組織修復(fù)、清除自由基等作用。本實(shí)驗(yàn)旨在觀心脈隆注射液對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化作用的影響,探討其是否可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。 目的 建立新生SD大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法；并鑒定神經(jīng)干細(xì)胞；探討心脈隆注射液對(duì)新生SD大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化作用的影響。 方法 1、從新生24h內(nèi)SD大鼠腦組織中分離海馬,采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng),并進(jìn)行傳代培養(yǎng),相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),將第3代以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Nestinn.5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine, Brdu)表達(dá)和神經(jīng)干細(xì)胞分化后微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein2,MAP-2)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表達(dá)。 2、將終濃度為0.5%、1%、2%的心脈隆注射液加入到第3代神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液中有血清貼壁培養(yǎng)并分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。每3d更換分化培養(yǎng)基1次,干預(yù)5d后倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)。 3、采用免疫熒光化學(xué)染色,觀察分化后細(xì)胞MAP-2、GFAP表達(dá)情況,應(yīng)用Image Pro plus6.0軟件計(jì)數(shù)MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),并計(jì)算分化率。 4、四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)觀察心脈隆注射液對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響。 5、將終濃度為2%的心脈隆注射液加入到第3代神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液中有血清培養(yǎng),并設(shè)立對(duì)照組,5-7d后用RTQ-PCR法檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達(dá)量。 6、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心脈隆注射液對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果 1、從新生SD大鼠海馬中分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有增殖、自我更新和分化的能力,神經(jīng)球免疫化學(xué)染色Nestin、BrdU陽(yáng)性,由其分化的細(xì)胞一部分神經(jīng)元特異性標(biāo)記物MAP-2陽(yáng)性、一部分星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP陽(yáng)性。 2、倒置顯微鏡下觀察,與對(duì)照組相比,心脈隆注射液干預(yù)組分化出更多的神經(jīng)元細(xì)胞,且免疫熒光化學(xué)染色后實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 3、四甲基偶氮唑鹽比色法結(jié)果顯示,細(xì)胞培養(yǎng)5d后,XML干預(yù)組OD值高于空白對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 4、熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達(dá)量大于對(duì)照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 5、流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示,各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間凋亡率無(wú)明顯差異。 結(jié)論 1、本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞,并且在體外擴(kuò)增、傳代,誘導(dǎo)分化后形成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,二者免疫熒光化學(xué)染色分別呈MAP-2和GFAP陽(yáng)性。 2、心脈隆注射液能夠在一定程度上促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。 3、心脈隆注射液可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2517127