【摘要】：傳統(tǒng)觀點認為,成人神經(jīng)細胞損傷后無法再生,功能無法重建,以致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及變性疾病患者的神經(jīng)功能很難恢復。近年研究發(fā)現(xiàn),在胚胎期和成年期哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中存在具有自我增殖、自我更新和多向分化潛能的神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs),神經(jīng)干細胞由胚胎早期的神經(jīng)上皮細胞產(chǎn)生,能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞,神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)不能再生的傳統(tǒng)理論提出了挑戰(zhàn),為研究神經(jīng)細胞的再生和功能重建帶來了新前景。然而,自然情況下,神經(jīng)干細胞大部分分化為膠質(zhì)細胞,僅少量分化為神經(jīng)元,目前尚無法有效控制神經(jīng)干細胞定向分化為特定的神經(jīng)細胞,因此,如何調(diào)控NSCs定向分化為功能性神經(jīng)元成為神經(jīng)科學研究領域的熱點和難點之一。心脈隆注射液(xinmailong injection, XML)是從昆蟲美洲大蠊體內(nèi)提取的核苷類化合物,有實驗研究結果表明,美洲大蠊提取物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、促血管增生和組織修復、清除自由基等作用。本實驗旨在觀心脈隆注射液對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞增殖分化作用的影響,探討其是否可以誘導神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化。 目的 建立新生SD大鼠海馬神經(jīng)干細胞體外分離培養(yǎng)方法；并鑒定神經(jīng)干細胞；探討心脈隆注射液對新生SD大鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖分化作用的影響。 方法 1、從新生24h內(nèi)SD大鼠腦組織中分離海馬,采用無血清懸浮培養(yǎng),并進行傳代培養(yǎng),相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),將第3代以免疫細胞化學法檢測Nestinn.5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine, Brdu)表達和神經(jīng)干細胞分化后微管相關蛋白2(microtubule-associated protein2,MAP-2)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表達。 2、將終濃度為0.5%、1%、2%的心脈隆注射液加入到第3代神經(jīng)干細胞單細胞懸液中有血清貼壁培養(yǎng)并分實驗組和對照組。每3d更換分化培養(yǎng)基1次,干預5d后倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)干細胞的形態(tài)。 3、采用免疫熒光化學染色,觀察分化后細胞MAP-2、GFAP表達情況,應用Image Pro plus6.0軟件計數(shù)MAP-2陽性細胞數(shù),并計算分化率。 4、四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)觀察心脈隆注射液對神經(jīng)干細胞增殖能力的影響。 5、將終濃度為2%的心脈隆注射液加入到第3代神經(jīng)干細胞單細胞懸液中有血清培養(yǎng),并設立對照組,5-7d后用RTQ-PCR法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達量。 6、應用流式細胞術檢測心脈隆注射液對神經(jīng)干細胞凋亡的影響。 結果 1、從新生SD大鼠海馬中分離培養(yǎng)的細胞具有增殖、自我更新和分化的能力,神經(jīng)球免疫化學染色Nestin、BrdU陽性,由其分化的細胞一部分神經(jīng)元特異性標記物MAP-2陽性、一部分星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP陽性。 2、倒置顯微鏡下觀察,與對照組相比,心脈隆注射液干預組分化出更多的神經(jīng)元細胞,且免疫熒光化學染色后實驗組明顯高于對照組,其差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。 3、四甲基偶氮唑鹽比色法結果顯示,細胞培養(yǎng)5d后,XML干預組OD值高于空白對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。 4、熒光實時定量PCR結果顯示,實驗組神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達量大于對照組,具有統(tǒng)計學差異。 5、流式細胞檢測結果顯示,各實驗組和對照組之間凋亡率無明顯差異。 結論 1、本實驗成功分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞,并且在體外擴增、傳代,誘導分化后形成神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞,二者免疫熒光化學染色分別呈MAP-2和GFAP陽性。 2、心脈隆注射液能夠在一定程度上促進神經(jīng)干細胞增殖。 3、心脈隆注射液可以促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：2517127