【摘要】：N15P多肽（序列：LGASWHRPDKCCLGY）是本課題組自主開發(fā)的一種CXCR4趨化因子受體的新型拮抗劑，已獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)（授權(quán)號(hào)：CN1872879B）。炎癥作為一種與人類多種疾病密切相關(guān)的病理現(xiàn)象，是當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一，但是目前治療炎癥藥物大多數(shù)副作用較大。由于趨化因子及其受體與炎癥過程密切相關(guān)，因此，本課題主要通過構(gòu)建體內(nèi)外的內(nèi)毒素炎癥模型，研究N15P肽對(duì)內(nèi)毒素性炎癥作用效應(yīng)及機(jī)制。 目的：擬通過構(gòu)建體內(nèi)外的內(nèi)毒素（LPS）炎癥模型，將N15P多肽作用于炎癥模型，探討N15P多肽對(duì)體內(nèi)外內(nèi)毒素（LPS）炎癥模型的作用效應(yīng)以及其作用機(jī)制，為將N15P多肽開發(fā)為新型的抗炎藥物打下研究基礎(chǔ)。 方法：本課題的主要研究?jī)?nèi)容包括兩大部分：（1）體外研究：內(nèi)毒素（LPS）刺激外周血單核細(xì)胞（PBMC），構(gòu)建內(nèi)毒素炎癥細(xì)胞模型，將不同濃度N15P多肽作用于該模型（對(duì)照藥物：地塞米松）。運(yùn)用ELISA及熒光實(shí)時(shí)定量PCR法，檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8蛋白以及mRNA含量的變化；經(jīng)典的Griess試劑法，檢測(cè)NO含量變化，探討N15P多肽對(duì)內(nèi)毒素炎癥細(xì)胞模型產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子、NO的抑制作用。同時(shí)，運(yùn)用western blot方法，檢測(cè)炎癥介質(zhì)NF-kB蛋白含量的變化，以及熒光實(shí)時(shí)定量PCR法，檢測(cè)炎癥介質(zhì)NF-kB、COX-2、TLR4、MyD88、PI3K、AKT mRNA含量的變化，從蛋白和mRNA水平探討N15P多肽對(duì)內(nèi)毒素炎癥體外細(xì)胞模型的影響及作用機(jī)制。 （2）體內(nèi)研究：內(nèi)毒素（LPS）腹腔注射入SPF級(jí)小鼠，構(gòu)建內(nèi)毒素炎癥動(dòng)物模型，將N15P多肽作用于該模型（對(duì)照藥物：地塞米松）。LPS注射后16h，眼眶取血處死小鼠，取小鼠肝臟、肺部器官常規(guī)保存。運(yùn)用血液分析儀進(jìn)行測(cè)定小鼠的血液血常規(guī)（包括：白細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白、嗜中性粒細(xì)胞％、淋巴細(xì)胞％、紅細(xì)胞壓積、血小板等）；另外，進(jìn)行血清分離，運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀，測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、堿性磷酸酶（ALP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）的含量。ELISA法測(cè)定小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8的含量變化；經(jīng)典的Griess試劑法，檢測(cè)血清中NO含量變化。常規(guī)制作小鼠肝臟、肺部病理切片，觀察器官損傷程度；免疫組化染色觀察NF－KB P65在肝臟細(xì)胞的表達(dá)情況；Western blot檢測(cè)NF-kB在肝臟細(xì)胞含量的變化；RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)肝臟組織中炎癥因子及介質(zhì)（NF-kB P65、COX-2、TLR4）的mRNA表達(dá)的變化。從器官病變程度、血液生化指標(biāo)、炎癥因子及介質(zhì)蛋白和mRNA水平等方面探討N15P多肽對(duì)內(nèi)毒素炎癥體內(nèi)小鼠模型的影響及作用機(jī)制。 結(jié)果： （一）體外研究部分內(nèi)容： （1）終濃度為10μg/mL的LPS作用于PBMC24h，能有效刺激炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8的分泌。 （2）ELISA檢測(cè)法結(jié)果顯示，與LPS組相比，中濃度組（5ng/ml）以及高濃度組（15ng/ml）的N15P多肽以及地塞米松均能有效抑制TNF-α、IL-6、IL-8蛋白表達(dá)（P㩳0.05）。 （3）熒光定量PCR結(jié)果表明，與LPS組相比，N15P多肽以及地塞米松均能有效減少細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8mRNA的表達(dá)（P㩳0.05）。 （4）NO檢測(cè)試劑盒結(jié)果顯示，N15肽用藥組及地塞米松對(duì)照組的NO含量與LPS刺激組相比，有顯著性減少（P㩳0.05）。 （5）western blot以及熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，N15肽用藥組以及地塞米松對(duì)照組均能有效減少細(xì)胞中NF-kB P65的蛋白含量以及mRNA的表達(dá)，與LPS刺激組相比，有顯著性差異（P㩳0.05）。 （6）熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，地塞米松用藥對(duì)照組并無明顯減少細(xì)胞中COX－2的mRNA的表達(dá)，與LPS刺激組相比，，無顯著性差異（P＞0.05）；但是，N15肽用藥組卻能有效抑制細(xì)胞中COX－2mRNA的表達(dá)，與LPS刺激組相比，有顯著性差異（P㩳0.05）�？梢�，N15肽與地塞米松的作用機(jī)制存在差異。 （7）熒光定量PCR結(jié)果表明，N15肽用藥組及地塞米松用藥對(duì)照組，均能有效抑制TLR4－MyD88以及PI3K－AKT這兩大信息通路介質(zhì)的mRNA表達(dá)，與LPS刺激組相比，有顯著性差異（P㩳0.05）。表明N15肽能有效影響兩大炎癥信號(hào)通路(TLR4－MyD88以及PI3K－AKT)，從而達(dá)到抑制炎癥發(fā)展進(jìn)程的作用。 (二)體內(nèi)研究部分內(nèi)容： （1）以LPS(20μg/kg)的劑量，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，能成功建立內(nèi)毒素小鼠炎癥模型。LPS感染組小鼠的肝臟和肺部均受到較為嚴(yán)重的損傷。 （2）血常規(guī)以及生化指標(biāo)檢測(cè)顯示，N15P肽及地塞米松均能有效抑制小鼠體內(nèi)的炎癥癥狀，且均能有效保護(hù)小鼠的肝臟，減少內(nèi)毒素對(duì)其傷害。 （3） ELISA結(jié)果顯示，N15肽及地塞米松組均對(duì)小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8蛋白分泌有明顯抑制作用。 （4）N15肽及地塞米松組均對(duì)小鼠血清中NO分泌有明顯抑制作用。 （5）用HE染色切片半定量評(píng)定組織壞死程度，N15P肽用藥組及地塞米松組的小鼠肝、肺組織的壞死程度，比LPS感染組均有明顯的改善，說明N15P肽用藥組及地塞米松組對(duì)小鼠肝臟、肺部起到了保護(hù)作用。 （6）免疫組化結(jié)果顯示，LPS感染組肝細(xì)胞中NF－KB P65呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而N15P肽用藥組和地塞米松組肝細(xì)胞中NF－KB P65呈弱陽性表達(dá)。 （7）western blot結(jié)果顯示，N15P肽用藥組和地塞米松組肝細(xì)胞中NF－KB P65的表達(dá)均比LPS感染組有顯著性減少（P㩳0.05）。說明N15P肽和地塞米松均能有效抑制NF－KB P65蛋白在肝組織中的表達(dá)。 （8）RT-PCR結(jié)果表明，N15P肽用藥組和地塞米松組肝細(xì)胞中NF－KB P65、TLR4的mRNA表達(dá)均比LPS感染組有明顯減少（P㩳0.05）；N15P肽用藥組COX-2mRNA比LPS感染組有明顯減少（P㩳0.05），而地塞米松組COX-2mRNA與LPS感染組無顯著性差異（P＞0.05）。 結(jié)論： N15P多肽無論是對(duì)內(nèi)毒素細(xì)胞炎癥模型，還是對(duì)內(nèi)毒素小鼠炎癥模型，均有良好的抑制炎癥因子（如：TNF-α、IL-6、IL-8、NO）及炎癥介質(zhì)（NF-kB、COX－2）蛋白及mRNA表達(dá)的能力，并且能有效抑制TLR4－MyD88及PI3K－AKT兩大炎癥信號(hào)通路的表達(dá)，并對(duì)小鼠肝臟及肺部具有保護(hù)作用，是一種具有開發(fā)前景的新型抗炎藥物！
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 孫冰;韓代書;;Toll樣受體信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2009年12期

本文編號(hào)：2516996