【摘要】：內涵體轉運是真核調節(jié)蛋白質功能的一個重要手段。蛋白需要通過內涵體轉運在適當的時間定位到適當的區(qū)域以發(fā)揮它正常的生理功能。同時內涵體轉運也可以通過修飾和降解等方法調節(jié)蛋白的活性。Sorting Nexins(SNXs)是一個新的與內涵體分選相關蛋白家族。它們以PX結構域為特征結構。PX結構域是個磷酸肌醇結合結構域,SNXs通過PX與磷酸肌醇的結合定位到內涵體膜上。由于SNXs在除PX結構域外的蛋白結構上較大的差異,這些成員在多樣的內涵體轉運通路上發(fā)揮功能。 SNX10,SNX11是SNXs家族結構最簡單的一類蛋白,除了PX結構域外不含有其它已知的功能性結構域。這兩個蛋白在氨基酸序列具有很高的相似性,在進化上也最為接近。但它們的功能完全未知。我們實驗室第一次發(fā)現在細胞中高表達SNX10可以誘導出巨大的空泡結構,但對這個過程的分子機制并不清楚。我們發(fā)現SNX10主要定位在Rab5陽性的早期內涵體上,而誘導出的空泡則顯示出晚期內涵體標記,說明SNX10可能開啟了一條通路,加速了由早期內涵體向晚期內涵體的轉變。而在這個過程中抑制Rab7可以起到抑制SNX10表型的作用,而Rab5抑制則不產生影響,說明這條通路不依賴于Rab5而依賴于Rab7。同時我們發(fā)現SNX11可以特異性的抑制SNX10的表型。SNX11在早期和晚期內涵體上都有部分定位。當SNX11與SNX10一起轉染入細胞時,SNX11與SNX10共定位在早期內涵體上,并抑制Rab7標記的晚期內涵體的擴大。進一步的研究發(fā)現,V-ATPase參與了SNX10誘導的空泡化。SNX10與V-ATPase的V1D亞基相互作用,由此V-ATPase被異常激活可能是增強的內涵體膜融合和酸化的原因。SNX11也與V1D亞基相互作用。SNX11,SNX10對V1D的結合具有競爭關系,并且SNX11表現出更強的親和力。V-ATPase的異�；钚砸彩荲acA誘導細胞空泡的原因,我們發(fā)現SNX11也可以抑制VacA誘導的空泡的形成。以上這些結果說明了SNX10,SNX11通過V-ATPase調節(jié)內涵體。 我們進一步在斑馬魚中研究SNX10的生理功能。用morpholino的方法敲降SNX10后,可以破壞斑馬魚的左右不對稱發(fā)育。KV(Kupffer’s Vesicle)是決定斑馬魚作用不對稱發(fā)育的重要器官,而KV中纖毛在其發(fā)揮功能的關鍵。我們發(fā)現在注射SNX10 morpholino的胚胎中,KV的纖毛形成受到抑制。體外實驗的結果表明SNX10調節(jié)細胞的纖毛發(fā)生。SNX10定位在纖毛基體的周圍。負責高爾基體與基體之間膜泡運輸的Rab11與SNX10表現出部分功定位。與纖毛膜泡轉運相關的蛋白BBS4,IFT88也表現出與SNX10的共定位。而用siRNA敲降SNX10可以阻礙細胞中的纖毛形成。因為SNX10/V-ATPase一起調節(jié)內涵體形態(tài),所以V-ATPase也可能參與對纖毛膜泡運輸的調控。用V1D和Vod1的GFP融合蛋白我們發(fā)現V-ATPase定位在基體上,與纖毛運輸相關的蛋白表現出共定位。在細胞中敲降V-ATPase可以抑制纖毛的形成,而在斑馬魚中敲降V-ATPase則在KV,原腎管,側線等多個器官中造成纖毛缺陷。而且在體內和體外實驗中,SNX10和V-ATPase對纖毛的調節(jié)都表現出協(xié)同作用。這些結果支持SNX10/V-ATPase通過膜泡轉運調節(jié)纖毛發(fā)生的假設。在進一步的研究中,我們發(fā)現V-ATPase在中心體上定位依賴于SNX10,在敲降SNX10的細胞中,V-ATPase在中心體上定位的比例明顯降低。這說明了在這過程中SNX10對V-ATPase的調節(jié)方式。同時我們也發(fā)現SNX10,V-ATPase的siRNA可以阻止Rab8向纖毛的轉運,這一結果從另一側面說明在纖毛發(fā)生過程中SNX10/V-ATPase對膜泡轉運的調節(jié)。 綜上所述,我們發(fā)現: 1, SNX10,SNX11調節(jié)早期內涵體向晚期內涵體的轉變,這個調節(jié)是通過V-ATPase來實現的。SNX10和SNX11都與V-ATPase的V1D亞基相互作用, 2, SNX11通過競爭性的與V1D結合來抑制SNX10的功能。 3, SNX10/V-ATPase途徑調節(jié)纖毛的發(fā)生。SNX10調節(jié)V-ATPase在中心體的定位。它們都是向纖毛方向的膜泡轉運所需要的。
【圖文】：

2圖 1.1 Rabs 與內涵體系統(tǒng)（Stenmark，2009） 真核細胞具有復雜的內涵體系統(tǒng)，調節(jié)細胞中不同結構之間的物質轉運。Rab small GTPase 是調節(jié)這些內涵體轉運的一類重要的蛋白。Rab5 調節(jié)從細胞質膜的內吞和早期內涵體的成熟。Rab7 調節(jié)早期內涵體向晚期內涵體的轉變和晚期內涵體-溶酶體的成熟過程。Rab9 調節(jié)從晚期內涵體向高爾基 TGN 的運輸。Rab11調節(jié)循環(huán)內涵體將膜泡及其內涵體物質循環(huán)到質膜上。Rab8，Rab17，Rab23 調節(jié)胞質向纖毛內的膜泡轉運。還有很多 Rab 在其他細胞器和膜泡之間的轉運中起作用。精細的膜泡結構區(qū)分和調節(jié)蛋白的分工形成復雜的內涵體系統(tǒng)。1.1.1 早期內涵體 early endosome（EE）細胞需要不停的與外界基質進行物質交換。細胞膜外物質通過多種途徑進入細胞的內涵

圖 1.2 Sorting Nexins 家族 （Cullen，2008） SNXs 家族的結構示意圖，所有 SNX 蛋白有PX 結構域為特征結構，除此之外不同的 SNX 含有的結構差別較大，根據擁有結構域的不同把 SNX 分為三類，第一類 SNX 都具有 Bar 結構域，稱為 Bar-SNX。第二類只有 PX 結構域，，對這一類目前只有很少的研究。第三類 SNX 具有其他差異較大的結構域。1.2.1 SNX1/SNX2，SNX5/SNX6SNX1 是第一個被發(fā)現的 SNX 蛋白，含有一個 PX 結構域和一個 Bar 結構域。SNX1 的PX 結構域以 PI(3,5)P2 為靶點，定位到內涵體膜上，對 EGFR 向晚期內涵體/溶酶體的轉運和降解起到重要的調節(jié)作用。在這個過程中，SNX1 與 Hr（sHepatocyte growth factor-regulatedtyrosine kinase substrate），EGFR 形成大的復合體并定位在早期內涵體上，調節(jié)了 EGFR 從早期內涵體向晚期內涵體的轉運(Kurten, Cadena et al. 1996; Chin, Raynor et al. 2001)。SNX1的另一功能是與 SNX2 一起調節(jié)向內涵體向 TGN 的 retrograde transport。SNX1 和 SNX2 可以形成同源二聚體或異二聚體，兩者在功能上可以相互替換。當 SNX1/SNX2 通過 PX 定位內涵體膜上時，它們將 VPS26/29/35 復合體募集到膜上,形成 retromer 復合體。這個復合體
【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：2516863