【摘要】：內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)是真核調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的一個(gè)重要手段。蛋白需要通過(guò)內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間定位到適當(dāng)?shù)膮^(qū)域以發(fā)揮它正常的生理功能。同時(shí)內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)也可以通過(guò)修飾和降解等方法調(diào)節(jié)蛋白的活性。Sorting Nexins(SNXs)是一個(gè)新的與內(nèi)涵體分選相關(guān)蛋白家族。它們以PX結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣鹘Y(jié)構(gòu)。PX結(jié)構(gòu)域是個(gè)磷酸肌醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域,SNXs通過(guò)PX與磷酸肌醇的結(jié)合定位到內(nèi)涵體膜上。由于SNXs在除PX結(jié)構(gòu)域外的蛋白結(jié)構(gòu)上較大的差異,這些成員在多樣的內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)通路上發(fā)揮功能。 SNX10,SNX11是SNXs家族結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的一類蛋白,除了PX結(jié)構(gòu)域外不含有其它已知的功能性結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)蛋白在氨基酸序列具有很高的相似性,在進(jìn)化上也最為接近。但它們的功能完全未知。我們實(shí)驗(yàn)室第一次發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中高表達(dá)SNX10可以誘導(dǎo)出巨大的空泡結(jié)構(gòu),但對(duì)這個(gè)過(guò)程的分子機(jī)制并不清楚。我們發(fā)現(xiàn)SNX10主要定位在Rab5陽(yáng)性的早期內(nèi)涵體上,而誘導(dǎo)出的空泡則顯示出晚期內(nèi)涵體標(biāo)記,說(shuō)明SNX10可能開(kāi)啟了一條通路,加速了由早期內(nèi)涵體向晚期內(nèi)涵體的轉(zhuǎn)變。而在這個(gè)過(guò)程中抑制Rab7可以起到抑制SNX10表型的作用,而Rab5抑制則不產(chǎn)生影響,說(shuō)明這條通路不依賴于Rab5而依賴于Rab7。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)SNX11可以特異性的抑制SNX10的表型。SNX11在早期和晚期內(nèi)涵體上都有部分定位。當(dāng)SNX11與SNX10一起轉(zhuǎn)染入細(xì)胞時(shí),SNX11與SNX10共定位在早期內(nèi)涵體上,并抑制Rab7標(biāo)記的晚期內(nèi)涵體的擴(kuò)大。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),V-ATPase參與了SNX10誘導(dǎo)的空泡化。SNX10與V-ATPase的V1D亞基相互作用,由此V-ATPase被異常激活可能是增強(qiáng)的內(nèi)涵體膜融合和酸化的原因。SNX11也與V1D亞基相互作用。SNX11,SNX10對(duì)V1D的結(jié)合具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,并且SNX11表現(xiàn)出更強(qiáng)的親和力。V-ATPase的異�；钚砸彩荲acA誘導(dǎo)細(xì)胞空泡的原因,我們發(fā)現(xiàn)SNX11也可以抑制VacA誘導(dǎo)的空泡的形成。以上這些結(jié)果說(shuō)明了SNX10,SNX11通過(guò)V-ATPase調(diào)節(jié)內(nèi)涵體。 我們進(jìn)一步在斑馬魚中研究SNX10的生理功能。用morpholino的方法敲降SNX10后,可以破壞斑馬魚的左右不對(duì)稱發(fā)育。KV(Kupffer’s Vesicle)是決定斑馬魚作用不對(duì)稱發(fā)育的重要器官,而KV中纖毛在其發(fā)揮功能的關(guān)鍵。我們發(fā)現(xiàn)在注射SNX10 morpholino的胚胎中,KV的纖毛形成受到抑制。體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明SNX10調(diào)節(jié)細(xì)胞的纖毛發(fā)生。SNX10定位在纖毛基體的周圍。負(fù)責(zé)高爾基體與基體之間膜泡運(yùn)輸?shù)腞ab11與SNX10表現(xiàn)出部分功定位。與纖毛膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白BBS4,IFT88也表現(xiàn)出與SNX10的共定位。而用siRNA敲降SNX10可以阻礙細(xì)胞中的纖毛形成。因?yàn)镾NX10/V-ATPase一起調(diào)節(jié)內(nèi)涵體形態(tài),所以V-ATPase也可能參與對(duì)纖毛膜泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控。用V1D和Vod1的GFP融合蛋白我們發(fā)現(xiàn)V-ATPase定位在基體上,與纖毛運(yùn)輸相關(guān)的蛋白表現(xiàn)出共定位。在細(xì)胞中敲降V-ATPase可以抑制纖毛的形成,而在斑馬魚中敲降V-ATPase則在KV,原腎管,側(cè)線等多個(gè)器官中造成纖毛缺陷。而且在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中,SNX10和V-ATPase對(duì)纖毛的調(diào)節(jié)都表現(xiàn)出協(xié)同作用。這些結(jié)果支持SNX10/V-ATPase通過(guò)膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)纖毛發(fā)生的假設(shè)。在進(jìn)一步的研究中,我們發(fā)現(xiàn)V-ATPase在中心體上定位依賴于SNX10,在敲降SNX10的細(xì)胞中,V-ATPase在中心體上定位的比例明顯降低。這說(shuō)明了在這過(guò)程中SNX10對(duì)V-ATPase的調(diào)節(jié)方式。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)SNX10,V-ATPase的siRNA可以阻止Rab8向纖毛的轉(zhuǎn)運(yùn),這一結(jié)果從另一側(cè)面說(shuō)明在纖毛發(fā)生過(guò)程中SNX10/V-ATPase對(duì)膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)。 綜上所述,我們發(fā)現(xiàn): 1, SNX10,SNX11調(diào)節(jié)早期內(nèi)涵體向晚期內(nèi)涵體的轉(zhuǎn)變,這個(gè)調(diào)節(jié)是通過(guò)V-ATPase來(lái)實(shí)現(xiàn)的。SNX10和SNX11都與V-ATPase的V1D亞基相互作用, 2, SNX11通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的與V1D結(jié)合來(lái)抑制SNX10的功能。 3, SNX10/V-ATPase途徑調(diào)節(jié)纖毛的發(fā)生。SNX10調(diào)節(jié)V-ATPase在中心體的定位。它們都是向纖毛方向的膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)所需要的。
【圖文】：

2圖 1.1 Rabs 與內(nèi)涵體系統(tǒng)（Stenmark，2009） 真核細(xì)胞具有復(fù)雜的內(nèi)涵體系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞中不同結(jié)構(gòu)之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。Rab small GTPase 是調(diào)節(jié)這些內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)的一類重要的蛋白。Rab5 調(diào)節(jié)從細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)吞和早期內(nèi)涵體的成熟。Rab7 調(diào)節(jié)早期內(nèi)涵體向晚期內(nèi)涵體的轉(zhuǎn)變和晚期內(nèi)涵體-溶酶體的成熟過(guò)程。Rab9 調(diào)節(jié)從晚期內(nèi)涵體向高爾基 TGN 的運(yùn)輸。Rab11調(diào)節(jié)循環(huán)內(nèi)涵體將膜泡及其內(nèi)涵體物質(zhì)循環(huán)到質(zhì)膜上。Rab8，Rab17，Rab23 調(diào)節(jié)胞質(zhì)向纖毛內(nèi)的膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)。還有很多 Rab 在其他細(xì)胞器和膜泡之間的轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用。精細(xì)的膜泡結(jié)構(gòu)區(qū)分和調(diào)節(jié)蛋白的分工形成復(fù)雜的內(nèi)涵體系統(tǒng)。1.1.1 早期內(nèi)涵體 early endosome（EE）細(xì)胞需要不停的與外界基質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)交換。細(xì)胞膜外物質(zhì)通過(guò)多種途徑進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)涵

圖 1.2 Sorting Nexins 家族 （Cullen，2008） SNXs 家族的結(jié)構(gòu)示意圖，所有 SNX 蛋白有PX 結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣鹘Y(jié)構(gòu)，除此之外不同的 SNX 含有的結(jié)構(gòu)差別較大，根據(jù)擁有結(jié)構(gòu)域的不同把 SNX 分為三類，第一類 SNX 都具有 Bar 結(jié)構(gòu)域，稱為 Bar-SNX。第二類只有 PX 結(jié)構(gòu)域，，對(duì)這一類目前只有很少的研究。第三類 SNX 具有其他差異較大的結(jié)構(gòu)域。1.2.1 SNX1/SNX2，SNX5/SNX6SNX1 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的 SNX 蛋白，含有一個(gè) PX 結(jié)構(gòu)域和一個(gè) Bar 結(jié)構(gòu)域。SNX1 的PX 結(jié)構(gòu)域以 PI(3,5)P2 為靶點(diǎn)，定位到內(nèi)涵體膜上，對(duì) EGFR 向晚期內(nèi)涵體/溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)和降解起到重要的調(diào)節(jié)作用。在這個(gè)過(guò)程中，SNX1 與 Hr（sHepatocyte growth factor-regulatedtyrosine kinase substrate），EGFR 形成大的復(fù)合體并定位在早期內(nèi)涵體上，調(diào)節(jié)了 EGFR 從早期內(nèi)涵體向晚期內(nèi)涵體的轉(zhuǎn)運(yùn)(Kurten, Cadena et al. 1996; Chin, Raynor et al. 2001)。SNX1的另一功能是與 SNX2 一起調(diào)節(jié)向內(nèi)涵體向 TGN 的 retrograde transport。SNX1 和 SNX2 可以形成同源二聚體或異二聚體，兩者在功能上可以相互替換。當(dāng) SNX1/SNX2 通過(guò) PX 定位內(nèi)涵體膜上時(shí)，它們將 VPS26/29/35 復(fù)合體募集到膜上,形成 retromer 復(fù)合體。這個(gè)復(fù)合體
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2516863