本文關(guān)鍵詞：人腸道菌群體外模型及潛在應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：建立人腸道菌群體外靜置培養(yǎng)模型和連續(xù)發(fā)酵模型,研究其潛在的應(yīng)用價值。方法：①建立人腸道菌群體外靜置培養(yǎng)模型,將自動釀酒綜合癥病人1例和健康志愿者2例的糞便分別接種于碳源為葡萄糖、淀粉、糊精和沒有碳源的VI培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),利用氣相色譜檢測8h、16h、24h和48h時培養(yǎng)基內(nèi)酒精濃度。將病人糞便分別接種于含有利福昔明、甲硝唑、左氧氟沙星、亞胺培南的抗生素培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng),用高效液相色譜檢測VFA含量,沉淀進行細菌DNA提取和16SrRNA基因高通量測序。②建立人腸道菌群體外連續(xù)發(fā)酵模型,取6個正常人(TXZ、FB、SQS、LW、WYS、CXX)的糞便樣品,利用以淀粉為碳源的培養(yǎng)基(VI)和以淀粉+多糖為碳源的培養(yǎng)基(XP)連續(xù)培養(yǎng),7d后取樣,上清檢測SCFA,沉淀用于細菌DNA提取和PCR-DGGE.糞便樣品和發(fā)酵第13天樣品的DNA做高通量測序。同樣方法,用單糖培養(yǎng)基(MD-1、MD-2)和改良VI培養(yǎng)基(VI-1、VI-2、VL)對LW進行模擬發(fā)酵。③建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型,將C57BL/6小鼠隨機分為6組,A組是空白組,B組是模型組,CDEF組是實驗組。A組給予無菌水,BCDEF組給予2%DSS自由飲用6天造模。第7、9、11天,A組和B組給予PBS灌胃,C組給予1%TXZ原始糞菌液,D組給予1%WYS原始糞菌液,E組給予TXZ凍干發(fā)酵產(chǎn)物,F組給予WYS凍干發(fā)酵產(chǎn)物灌胃(0.1 m1/10 g體重)。每天記錄小鼠存活數(shù)量和生存狀態(tài)至第13天。站果：①通過靜止模型研究證明自動釀酒綜合征病人糞便菌群體外發(fā)酵產(chǎn)生高濃度的酒精,和正常人糞便菌群相比較,病人糞便接種在葡萄糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生高含量的酒精(P0.05)。同時病人糞便菌群在葡萄糖中產(chǎn)生的酒精含量比在淀粉、糊精的培養(yǎng)基中高(P0.05)。用含有利福昔明、甲硝唑、左氧氟沙星的培養(yǎng)基培養(yǎng)病人腸道菌群仍可以產(chǎn)生酒精,但在亞胺培南培養(yǎng)基中酒精產(chǎn)量幾乎為零。16s rRNA測序證明在含有亞胺培南培養(yǎng)基發(fā)酵后Escherichia-Shigella、Parasutterella、Veillonella數(shù)量明顯減少,顯示這些細菌可能參與了體內(nèi)酒精的產(chǎn)生。②在體外連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)模擬人腸道菌群研究中共完成6個人的腸道菌群體外模擬試驗,比較了兩種發(fā)酵培養(yǎng)基VI和XP體外模擬效果。發(fā)酵罐平衡8天后DGGE圖條帶數(shù)目和亮度保持恒定,發(fā)酵罐開始進入平衡狀態(tài)。通過16s rRNA測序比較原始接種糞便樣品的菌群結(jié)構(gòu)和發(fā)酵產(chǎn)物的菌群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)所有樣品含有80～160個OTU,發(fā)酵樣品OTU數(shù)量均少于相對應(yīng)的糞便樣品。同一個人的糞便樣品在XP培養(yǎng)基內(nèi)的OTU數(shù)量比VI多。而6個試驗對象的腸道菌群結(jié)構(gòu)顯示兩種已經(jīng)報告過的腸型,即TXZ、FB、SQS的糞便樣品中擬桿菌屬含量高,屬于擬桿菌腸型；而LW、WYS、CXX糞便樣品則以普雷沃氏菌屬為主,屬于普雷沃菌腸型。在糞便樣品中主要有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門,而發(fā)酵樣品為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門。在門的水平上,發(fā)酵樣品與糞便樣品種類相似。在不考慮豐度時,VI和XP對6個人糞便細菌的模擬相似性均為50%左右,其中VI培養(yǎng)基對TXZ、SQS的模擬效果較好,而XP培養(yǎng)基對FB、LW、CXX的模擬效果較好。在考慮豐度時,VI和XP培養(yǎng)基對擬桿菌腸型的糞便樣品的模擬效果在80%-90%,而對普雷沃菌腸型的模擬相似性在25%以下。測定了發(fā)酵罐內(nèi)產(chǎn)生10-30 mmol/L SCFA,最多的是丁酸和丙酸。③本研究的最后部分評估了不同腸型的糞便接種物和發(fā)酵產(chǎn)物對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎(DSS)模型中炎癥的影響。和A組相比,B組小鼠第6天墊料和肛門口出現(xiàn)血漬,疾病活動指數(shù)(DAI)升高。結(jié)腸HE染色切片模型組粘膜結(jié)構(gòu)破壞,多發(fā)淺潰瘍和炎性細胞浸潤,顯示造模成功。接種兩種腸型的糞便菌群后,小鼠(C組擬桿菌腸型；D組普雷沃菌腸型)大量死亡。而接種相對應(yīng)的發(fā)酵物(E組和F組)小鼠死亡數(shù)量與模型組相同。結(jié)論：本實驗建立的體外靜置培養(yǎng)模型可用于快速、短時、批量檢測腸道病原菌。建立的體外連續(xù)發(fā)酵模型對擬桿菌為主的腸道菌群模擬效果達80%以上,對普雷沃氏菌為主的腸道菌群模擬效果在25%以下,模型效果較低。人糞便制品和發(fā)酵產(chǎn)物移植小鼠UC模型不成功,需要進一步實驗研究。
【關(guān)鍵詞】：腸道菌群 體外模型 模擬發(fā)酵 潰瘍性結(jié)腸炎
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R333.3
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 第一章 人腸道菌群體外靜置培養(yǎng)模型的研究和應(yīng)用14-25
• 1.1 實驗設(shè)計14
• 1.2 實驗材料14-16
• 1.3 實驗方法16-20
• 1.4 結(jié)果20-23
• 1.5 討論23-25
• 第二章 人腸道菌群體外連續(xù)發(fā)酵模型的建立和評估25-45
• 2.1 實驗設(shè)計25
• 2.2 實驗材料25-26
• 2.3 實驗方法26-31
• 2.4 結(jié)果31-40
• 2.5 針對普雷沃氏菌腸型的模擬研究40-43
• 2.6 討論43-45
• 第三章 發(fā)酵產(chǎn)物對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的初步運用45-51
• 3.1 實驗設(shè)計45
• 3.2 實驗材料45-46
• 3.3 實驗方法46-47
• 3.4 結(jié)果47-49
• 3.5 討論49-51
• 第四章 結(jié)論51-52
• 參考文獻52-55
• 文獻綜述55-67
• 參考文獻61-67
• 附錄67-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況69-70
• 致謝70

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本文編號：251599