【摘要】：蛋白質酪氨酸磷酸化對諸多基本細胞過程起著關鍵的調控作用，包括細胞生長、粘附、增殖等。因為蛋白質酪氨酸激酶（Protein Tyrosine Kinases, PTKs）與蛋白質酪氨酸磷脂酶（Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs）的相互拮抗，所以一個特定蛋白質的酪氨酸磷酸化水平是PTKs和PTPs共同作用的結果。最近研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸磷酸化過程受雙氧水(Hydrogen Peroxide, H_2O_2)介導的氧化還原過程調節(jié)。證據(jù)顯示H_2O_2可以通過氧化PTPs活性中心的半胱氨酸殘基而抑制其活性。目前逐漸形成有關H_2O_2在生長因子誘導的酪氨酸磷酸化信號中的作用的假說：PTKs的激活不足以提高蛋白質的酪氨酸磷酸化穩(wěn)態(tài)水平，同時也需要內(nèi)源性H_2O_2介導的PTPs抑制作用的參與。雖然H_2O_2參與酪氨酸磷酸化信號通路的分子機制已經(jīng)被廣為接受，但是H_2O_2是以何種方式調節(jié)酪氨酸磷酸化信號動力學過程及其特點仍不清楚，尤其是缺乏活細胞內(nèi)的實時動態(tài)調節(jié)信息；此外，在外源性H_2O_2誘導的氧化應激中，細胞內(nèi)谷胱甘肽（Glutathione, GSH）氧化還原電勢與酪氨酸磷酸化動力學之間的關系至今未見報道。 本研究使用基于熒光蛋白的熒光能量共振轉移（Fluorescence Resonance EnergyTransfer, FRET）探針Src探針在活細胞水平對上表皮生長因子（Epidermal GrowthFactor, EGF）誘導的和Src激酶介導的酪氨酸磷酸化過程（簡稱Src信號）進行了定量研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H_2O_2通過抑制PTPs活性，正向地調節(jié)Src信號的峰值強度和持續(xù)時間。為了在單個細胞內(nèi)對Src信號動力學與外源性H_2O_2誘導的細胞GSH氧化還原電勢變化動力學進行同步研究，，我們發(fā)展了基于mVenus/mKOκ FRET對的Src探針和基于單個熒光蛋白的Grx1-roGFP2探針的雙分子成像方法，在單個細胞中，實現(xiàn)了Src信號和氧化還原電勢信號動力學變化的實時同步成像。研究顯示，在外源性H_2O_2誘導下，細胞內(nèi)GSH氧化還原體系參與負調節(jié)EGF誘導的Src信號。 主要研究結果如下： 1）活細胞內(nèi)，在EGF刺激下，利用Src光學探針，我們得到了Src信號動力學。 結果顯示Src信號動力學曲線與用生化方法得到的EGF誘導的細胞外信號調節(jié)激酶（Extracellular signal-regulated kinase, ERK）信號動力學曲線類似，通過借鑒用來描述ERK動力學的數(shù)學模型和參數(shù)，我們引入三個簡化的參數(shù)來定量描述Src信號動力學：信號峰值、信號持續(xù)時間和積分信號強度。并建立了這三個參數(shù)與Src活化程度和PTPs活性之間的關聯(lián)。 2）在活細胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H_2O_2通過抑制PTPs活性來調節(jié)Src的信號峰值和持續(xù)時間。通過細胞內(nèi)表達H_2O_2相關調節(jié)基因Rac1-N17和Prx1-Y197F，降低內(nèi)源H_2O_2水平，結果顯示Src的信號峰值和持續(xù)時間均大大降低。而PTPs特異抑制劑vanadate能夠消除此影響。 3）結果提示EGF誘導的內(nèi)源性H_2O_2必須局部產(chǎn)生，這樣可以避免觸發(fā)細胞抗氧化防御機制。動力學數(shù)據(jù)顯示這個防御機制不利于Src介導的酪氨酸磷酸化信號。 4）發(fā)展了基于黃色熒光蛋白mVenus和橙色熒光蛋白mKOκ的新FRET對，建立了基于mVenus/mKOκ (簡稱YO) FRET對和單熒光蛋白探針Grx1-roGFP2的雙比率實時同步成像新方法。實驗結果顯示，在進行多色熒光信號雙比率實時成像時，無需特殊的算法處理，即可獲得雙生物分子信號互不干擾的動態(tài)信息。 5）設計了基于YO FRET對的Src激酶探針：YO-Src。在單細胞內(nèi)，對YO-Src和Grx1-roGFP2探針進行同步成像，結果顯示，外源H_2O_2對EGF誘導的Src信號起負向調節(jié)作用。 本論文，以可視化、定量化的實驗方法，在活細胞水平，顯示了EGF誘導的Src信號動力學。闡明了內(nèi)源性和外源性H_2O_2在Src信號動力學中的作用特點，同時增進了對信號分子H_2O_2在細胞中重要作用的理解。本論文建立的熒光信號定量表征分子事件的研究方法，也適用于其它信號途徑中分子事件的研究；建立的雙比率成像方法，可以廣泛地應用到細胞信號轉導途徑雙分子事件時空特性描述中。
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圖片說明： 3圖 1.1 PTKs 和 PTPs 家族[1]。（A）PTKs 通常可以分為膜受體和細胞質激酶兩類，分別為 RTKs和 cPTKs。（B）PTPs 家族可以分為酪氨酸特異性和雙特異性兩類。酪氨酸特異性酯酶又可進一步分為受體樣和細胞質酯酶兩種，分別為 RPTPs 和 cPTPs。
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圖片說明： Src 激酶有著復雜而精細的結構（圖 1.2），用來調節(jié)自身酶活性[9]。 Src 在 N端有一個特殊的區(qū)域，包含有豆蔻酰化位點，影響亞細胞定位；SH3 結構域，能特異地與富含脯氨酸的基序結合介導分子內(nèi)或是分子間的相互作用； SH2 結構域，能特異地結合在磷酸化的酪氨酸位點基序；一個連接結構域，參與結合分子內(nèi) SH3結構域；負責催化反應的激酶結構域（又稱 SH1 結構域），這個結構域包括一個控制與底物結合的 activation loop（A-loop），和一個自催化位點 Tyr416，此位點的磷酸化使得激酶處于最大活性狀態(tài)；C 端的尾巴多肽，包括一個 Tyr527，此位點的磷酸化后，與 SH2 結構域結合，使得 Src 激酶處于失活的狀態(tài)。由于 Src 激酶在細胞中的重要性，所以 Src 的活性受到了嚴密的調控。而 Src復雜的調節(jié)機制使得 Src 能處于不同的活性水平[10]。一個是完全失活形式，這個形式特點是 SH3/SH2 的相互作用、磷酸化的 Tyr527 和非磷酸化狀態(tài)的 A-loop。部分活性形式，這個形式特點是 SH3/SH2 的相互作用被破壞，但是 A-loop 仍處于非磷酸化的狀態(tài)。完全活化的形式，這個形式的特點是 A-loop 處于磷酸化狀態(tài)。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R341


本文編號：2515365