【摘要】：蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化對(duì)諸多基本細(xì)胞過(guò)程起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附、增殖等。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)酪氨酸激酶（Protein Tyrosine Kinases, PTKs）與蛋白質(zhì)酪氨酸磷脂酶（Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs）的相互拮抗，所以一個(gè)特定蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化水平是PTKs和PTPs共同作用的結(jié)果。最近研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸磷酸化過(guò)程受雙氧水(Hydrogen Peroxide, H_2O_2)介導(dǎo)的氧化還原過(guò)程調(diào)節(jié)。證據(jù)顯示H_2O_2可以通過(guò)氧化PTPs活性中心的半胱氨酸殘基而抑制其活性。目前逐漸形成有關(guān)H_2O_2在生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化信號(hào)中的作用的假說(shuō)：PTKs的激活不足以提高蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化穩(wěn)態(tài)水平，同時(shí)也需要內(nèi)源性H_2O_2介導(dǎo)的PTPs抑制作用的參與。雖然H_2O_2參與酪氨酸磷酸化信號(hào)通路的分子機(jī)制已經(jīng)被廣為接受，但是H_2O_2是以何種方式調(diào)節(jié)酪氨酸磷酸化信號(hào)動(dòng)力學(xué)過(guò)程及其特點(diǎn)仍不清楚，尤其是缺乏活細(xì)胞內(nèi)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)信息；此外，在外源性H_2O_2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（Glutathione, GSH）氧化還原電勢(shì)與酪氨酸磷酸化動(dòng)力學(xué)之間的關(guān)系至今未見(jiàn)報(bào)道。 本研究使用基于熒光蛋白的熒光能量共振轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance EnergyTransfer, FRET）探針Src探針在活細(xì)胞水平對(duì)上表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal GrowthFactor, EGF）誘導(dǎo)的和Src激酶介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化過(guò)程（簡(jiǎn)稱Src信號(hào)）進(jìn)行了定量研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H_2O_2通過(guò)抑制PTPs活性，正向地調(diào)節(jié)Src信號(hào)的峰值強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。為了在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)對(duì)Src信號(hào)動(dòng)力學(xué)與外源性H_2O_2誘導(dǎo)的細(xì)胞GSH氧化還原電勢(shì)變化動(dòng)力學(xué)進(jìn)行同步研究，，我們發(fā)展了基于mVenus/mKOκ FRET對(duì)的Src探針和基于單個(gè)熒光蛋白的Grx1-roGFP2探針的雙分子成像方法，在單個(gè)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)了Src信號(hào)和氧化還原電勢(shì)信號(hào)動(dòng)力學(xué)變化的實(shí)時(shí)同步成像。研究顯示，在外源性H_2O_2誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)GSH氧化還原體系參與負(fù)調(diào)節(jié)EGF誘導(dǎo)的Src信號(hào)。 主要研究結(jié)果如下： 1）活細(xì)胞內(nèi)，在EGF刺激下，利用Src光學(xué)探針，我們得到了Src信號(hào)動(dòng)力學(xué)。 結(jié)果顯示Src信號(hào)動(dòng)力學(xué)曲線與用生化方法得到的EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signal-regulated kinase, ERK）信號(hào)動(dòng)力學(xué)曲線類似，通過(guò)借鑒用來(lái)描述ERK動(dòng)力學(xué)的數(shù)學(xué)模型和參數(shù)，我們引入三個(gè)簡(jiǎn)化的參數(shù)來(lái)定量描述Src信號(hào)動(dòng)力學(xué)：信號(hào)峰值、信號(hào)持續(xù)時(shí)間和積分信號(hào)強(qiáng)度。并建立了這三個(gè)參數(shù)與Src活化程度和PTPs活性之間的關(guān)聯(lián)。 2）在活細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H_2O_2通過(guò)抑制PTPs活性來(lái)調(diào)節(jié)Src的信號(hào)峰值和持續(xù)時(shí)間。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)H_2O_2相關(guān)調(diào)節(jié)基因Rac1-N17和Prx1-Y197F，降低內(nèi)源H_2O_2水平，結(jié)果顯示Src的信號(hào)峰值和持續(xù)時(shí)間均大大降低。而PTPs特異抑制劑vanadate能夠消除此影響。 3）結(jié)果提示EGF誘導(dǎo)的內(nèi)源性H_2O_2必須局部產(chǎn)生，這樣可以避免觸發(fā)細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示這個(gè)防御機(jī)制不利于Src介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化信號(hào)。 4）發(fā)展了基于黃色熒光蛋白mVenus和橙色熒光蛋白mKOκ的新FRET對(duì)，建立了基于mVenus/mKOκ (簡(jiǎn)稱YO) FRET對(duì)和單熒光蛋白探針Grx1-roGFP2的雙比率實(shí)時(shí)同步成像新方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在進(jìn)行多色熒光信號(hào)雙比率實(shí)時(shí)成像時(shí)，無(wú)需特殊的算法處理，即可獲得雙生物分子信號(hào)互不干擾的動(dòng)態(tài)信息。 5）設(shè)計(jì)了基于YO FRET對(duì)的Src激酶探針：YO-Src。在單細(xì)胞內(nèi)，對(duì)YO-Src和Grx1-roGFP2探針進(jìn)行同步成像，結(jié)果顯示，外源H_2O_2對(duì)EGF誘導(dǎo)的Src信號(hào)起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。 本論文，以可視化、定量化的實(shí)驗(yàn)方法，在活細(xì)胞水平，顯示了EGF誘導(dǎo)的Src信號(hào)動(dòng)力學(xué)。闡明了內(nèi)源性和外源性H_2O_2在Src信號(hào)動(dòng)力學(xué)中的作用特點(diǎn)，同時(shí)增進(jìn)了對(duì)信號(hào)分子H_2O_2在細(xì)胞中重要作用的理解。本論文建立的熒光信號(hào)定量表征分子事件的研究方法，也適用于其它信號(hào)途徑中分子事件的研究；建立的雙比率成像方法，可以廣泛地應(yīng)用到細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑雙分子事件時(shí)空特性描述中。
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圖片說(shuō)明： 3圖 1.1 PTKs 和 PTPs 家族[1]。（A）PTKs 通�？梢苑譃槟な荏w和細(xì)胞質(zhì)激酶兩類，分別為 RTKs和 cPTKs。（B）PTPs 家族可以分為酪氨酸特異性和雙特異性兩類。酪氨酸特異性酯酶又可進(jìn)一步分為受體樣和細(xì)胞質(zhì)酯酶兩種，分別為 RPTPs 和 cPTPs。
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圖片說(shuō)明： Src 激酶有著復(fù)雜而精細(xì)的結(jié)構(gòu)（圖 1.2），用來(lái)調(diào)節(jié)自身酶活性[9]。 Src 在 N端有一個(gè)特殊的區(qū)域，包含有豆蔻�；稽c(diǎn)，影響亞細(xì)胞定位；SH3 結(jié)構(gòu)域，能特異地與富含脯氨酸的基序結(jié)合介導(dǎo)分子內(nèi)或是分子間的相互作用； SH2 結(jié)構(gòu)域，能特異地結(jié)合在磷酸化的酪氨酸位點(diǎn)基序；一個(gè)連接結(jié)構(gòu)域，參與結(jié)合分子內(nèi) SH3結(jié)構(gòu)域；負(fù)責(zé)催化反應(yīng)的激酶結(jié)構(gòu)域（又稱 SH1 結(jié)構(gòu)域），這個(gè)結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)控制與底物結(jié)合的 activation loop（A-loop），和一個(gè)自催化位點(diǎn) Tyr416，此位點(diǎn)的磷酸化使得激酶處于最大活性狀態(tài)；C 端的尾巴多肽，包括一個(gè) Tyr527，此位點(diǎn)的磷酸化后，與 SH2 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使得 Src 激酶處于失活的狀態(tài)。由于 Src 激酶在細(xì)胞中的重要性，所以 Src 的活性受到了嚴(yán)密的調(diào)控。而 Src復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制使得 Src 能處于不同的活性水平[10]。一個(gè)是完全失活形式，這個(gè)形式特點(diǎn)是 SH3/SH2 的相互作用、磷酸化的 Tyr527 和非磷酸化狀態(tài)的 A-loop。部分活性形式，這個(gè)形式特點(diǎn)是 SH3/SH2 的相互作用被破壞，但是 A-loop 仍處于非磷酸化的狀態(tài)。完全活化的形式，這個(gè)形式的特點(diǎn)是 A-loop 處于磷酸化狀態(tài)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R341


本文編號(hào)：2515365