【摘要】：粘細(xì)菌纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)是抗腫瘤藥物埃博霉素的產(chǎn)生菌,埃博霉素具有和紫杉醇類似的抗腫瘤活性,并且具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,水溶性好,毒副作用小,不易誘發(fā)耐藥性等諸多優(yōu)于紫杉醇的優(yōu)點(diǎn),尤其對(duì)紫杉醇類耐藥的腫瘤細(xì)胞具有較高活性,使其具有巨大的藥用價(jià)值。但其合成技術(shù)上的瓶頸嚴(yán)重制約了該類藥物的研發(fā)；遺傳操作手段的缺乏,則進(jìn)一步限制了埃博霉素生物合成調(diào)控及遺傳改造的研究。為了從根本上了解埃博霉素的調(diào)控機(jī)制,提高埃博霉素的產(chǎn)量,我們進(jìn)行了纖維堆囊菌So0157-2埃博霉素合成相關(guān)的調(diào)控蛋白進(jìn)行了分離和鑒定。 我們通過生物素同鏈霉親和素相互作用的磁珠,利用埃博霉素合成基因簇上游的非編碼區(qū)對(duì)不同培養(yǎng)條件下的So0157-2埃博霉素調(diào)控蛋白進(jìn)行釣取。選擇埃博霉素產(chǎn)量有明顯差異的合成培養(yǎng)基和M26培養(yǎng)基對(duì)埃博霉素調(diào)控蛋白進(jìn)行DNA pull-down實(shí)驗(yàn)。為了獲得盡可能多的調(diào)控因子,選擇埃博霉素合成基因簇與上游可預(yù)測(cè)的編碼基因之間的1332bp的序列作為pull-down的誘餌。獲得的兩種培養(yǎng)條件下的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分惜,將合成培養(yǎng)條件下和M26培養(yǎng)條件下的差異蛋白進(jìn)行shot-gun質(zhì)譜檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果同So ce56數(shù)據(jù)庫比對(duì)獲得16個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,同So0157-2數(shù)據(jù)庫比對(duì)獲得5個(gè)So0157-2特有的調(diào)控因子,經(jīng)過生物信息學(xué)分析后從中選擇了三個(gè)蛋白命名為Etf1、Etf2、Etf3。分別對(duì)Etf1、Etf2、Etf3構(gòu)建表達(dá)載體,異源表達(dá)并純化獲得Etf1、Etf2、Etf3純蛋白,利用EMSA對(duì)這三個(gè)貨白進(jìn)行體外結(jié)合活性的驗(yàn)證。纖維堆囊菌So0157-2的遺傳操作體系尚不完善造成了我們對(duì)于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子體內(nèi)調(diào)控作用進(jìn)行深入探索的困難,因此我們將調(diào)控序列和調(diào)控蛋白分別克隆到兩個(gè)質(zhì)粒上。其中So0157-2埃博霉素合成基因簇上游調(diào)控序列USE(upstream sequence of epothilone biosynthetic gene clusters,1332bp)、CUSE(conserved USE,425bp)、PUSE(putative USE,158bp)連上綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因后克隆入pET-28a載體中,新構(gòu)建的質(zhì)粒分別編號(hào)為pWLUSE01、pWLUSE02、 pWLUSE03;將調(diào)控蛋白Etfl、Etf2和Etf3基因克隆入pBAD33,置于阿拉伯糖啟動(dòng)子下,分別編號(hào)為pWLETFO、pWLETF02、pWLETF03。將構(gòu)建好的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到Ecoli Top1OF感受態(tài)細(xì)胞中。 Etfl能同埃博霉素合成基因簇上游調(diào)控序列1332bp全長(zhǎng)USE (upstream sequence of epothilone biosynthetic gene clusters)、CUSE (conserved USE)結(jié)合形成清晰的阻滯條帶,證實(shí)Etfl可以和USE、CUSE結(jié)合,在加入了非特異競(jìng)爭(zhēng)性DNA PolydIdC后仍然有阻滯現(xiàn)象,證實(shí)Etf1的結(jié)合是特異的,并且Etfl的結(jié)合受鹽離子濃度的影響不大,Etf2、Etf3的結(jié)合微弱阻滯現(xiàn)象不明顯。為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)的調(diào)控作用,我們建立了異源體內(nèi)結(jié)合體系,以Etf1為例進(jìn)行了驗(yàn)證。首先采用RT-PCR方法對(duì)Etfl的表達(dá)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄分析,驗(yàn)證Etfl基因的轉(zhuǎn)錄,接著采用Westernblot證實(shí)了Etf1的表達(dá)。利用分光光度計(jì)對(duì)pWLETF0l同pWLUSEO1、pWLUSE02、pWLUSE03共轉(zhuǎn)化的菌休在誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)條件下的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示pWLETF01同pWLUSE01, pWLUSE02共轉(zhuǎn)化的菌體在未誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)條件下均能檢測(cè)到熒光信號(hào)。前者熒光強(qiáng)度隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增強(qiáng)；后者在添加了誘導(dǎo)劑阿拉伯糖后,熒光強(qiáng)度就不再隨時(shí)間的增加而增強(qiáng)。pWLETF01同pWLUSE03共轉(zhuǎn)化的菌體在誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)條件下均未檢測(cè)到熒光信號(hào),由此此可知埃博霉素合成基因簇上游調(diào)控序列USE、CUSE可以被大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識(shí)別并啟動(dòng)下游報(bào)告基因EGFP的轉(zhuǎn)錄,而PUSE不能被其識(shí)別。Etfl作為負(fù)調(diào)控因子同USE01、USE02結(jié)合而阻遏下游報(bào)告基因EGFP的表達(dá)。同時(shí)也證明我們的異源結(jié)合體系是可行的。利用異源體內(nèi)結(jié)合體系對(duì)另外兩個(gè)蛋白Etf2、Etf3進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果熒光信號(hào)并沒有變化,由于EMSA的結(jié)果顯示Etf2、Etf3在體外DNA結(jié)合活性較弱,說明Etf2、Etf3在體內(nèi)的DNA結(jié)合也相對(duì)較弱。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李越中,李健,周璐,張勇,胡瑋,陳琦;我國(guó)粘細(xì)菌(Myxobacteria)資源的分離與鑒定[J];微生物學(xué)報(bào);2000年06期

2 吳斌輝,李越中,胡瑋,周璐,侯配斌;纖維堆囊菌的多細(xì)胞形態(tài)發(fā)生過程[J];微生物學(xué)報(bào);2002年06期

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本文編號(hào)：2514968