【摘要】：雙歧桿菌在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、抑制病原微生物的侵入、抗腫瘤、抗突變和抗衰老等方面具有重要的作用。雙歧桿菌對腸黏膜上皮細胞的黏附和定植是其發(fā)揮生理作用的前提,也是評價其作為微生態(tài)活菌制劑的一個重要指標(biāo)。 本文主要探究了黏附蛋白BIF在雙歧桿菌屬中的分布,探求了長雙歧桿菌未知功能的黏附蛋白的存在。即：1、通過分子克隆表達技術(shù)獲得了長雙歧桿菌黏附蛋白BIF,并從四株雙歧桿菌中獲得了類BIF蛋白的基因和蛋白；2、以磁性納米材料為載體,直接篩選獲得了黏附腸上皮細胞的長雙歧桿菌的表面蛋白；3、對上述蛋白體外黏附腸上皮細胞的生物學(xué)功能進行了初步研究。 有關(guān)論文的詳細內(nèi)容分述如下。 益生菌和致病菌的黏附是影響宿主健康的重要步驟。本文綜述了近年來益生菌及致病菌對腸道上皮細胞黏附機制的研究進展,比較了其黏附后的生物學(xué)效應(yīng)差異,重點對兩者之間的競爭性黏附作用進行了概述。在上述基礎(chǔ)上對益生菌抑制致病菌的研究前景和發(fā)展趨勢進行了展望。 雙歧桿菌的黏附蛋白BIF在益生菌中的分布及功能差異鮮有報道,為此本文開展了較為詳細的研究。首先,本文以長雙歧桿菌的BIF為研究對象,成功構(gòu)建了pBIF-GEX重組表達質(zhì)粒,經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后誘導(dǎo)表達,GST親和柱純化,獲得了高純度的BIF蛋白。量子點標(biāo)記,BIF蛋白證實了其與腸上皮細胞HT-29的黏附。平板計數(shù)法驗證了BIF對單核增生李斯特菌和大腸桿菌O157：H7黏附HT-29具有明顯的抑制作用,而對長雙歧桿菌和植物乳桿菌的黏附?jīng)]有顯著影響。50μg/mL的BIF能使單核增生李斯特菌的黏附率從41.6%降到8.6%,大腸桿菌0157：H7從44.3%降到10.4%；BIF濃度對HT-29細胞的細胞因子IL-4、IL-8的產(chǎn)生呈正相關(guān),而對TNF-a無顯著影響。 為從益生菌中獲得BIF或類BIF的基因和蛋白,本文制備了抗BIF蛋白的鼠源多克隆抗體,通過斑點雜交法篩選,證實了嬰兒雙歧WBIN03,嬰兒雙歧WBAN07,青春雙歧WBAD08,乳雙歧WLABO9存在BIF蛋白。以bif-F1、bif-R1為引物,驗證了上述4株雙歧桿菌中bif基因的存在,bif基因與bif基因的同源率分別達到89.71%、82.53%、90.75%和82.91%。類似地,克隆表達的這四種BIF蛋白中有三種BIF類似蛋白被證實對腸上皮細胞有黏附功能。 探求未知功能的雙歧桿菌黏附蛋白是一項具有挑戰(zhàn)性的研究。為此,本文采用了磁珠偶聯(lián)腸上皮細胞碎片,與長雙歧桿菌膜蛋白相互作用的策略,分離了4種黏附相關(guān)蛋白。經(jīng)質(zhì)譜測序、生物信息學(xué)分析,獲得了完整的蛋白序列和基因序列。同樣,經(jīng)克隆表達、量子點標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)這四種蛋白中的三種對HT-29細胞有黏附功能。其中PP1對HT-29細胞因子IL4、IL-8、TNF-α的產(chǎn)生有顯著影響。 綜上所述,探究益生菌的黏附蛋白和相關(guān)基因,在細胞水平上研究益生菌對致病菌的黏附拮抗以及對腸上皮細胞產(chǎn)細胞因子的影響,對提高我國在益生菌研究領(lǐng)域的分子研究水平,為功能基因和功能蛋白在微生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。采用磁珠法獲得益生菌的黏附蛋白,通過量子點標(biāo)記驗證其黏附功能,是益生菌功能研究方面的一種創(chuàng)新。本研究將為今后開展益生菌的功能基因和蛋白的研究,提供一種方法學(xué)和新的思路。
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圖片說明： 第二章長雙歧桿菌BIF的克隆表達及功能驗證雙歧桿菌DNA提取結(jié)果如圖2.1所示。Mr(卜l，) 2313094!66557436)23222027圖2.1基因組ONA電泳圖譜說明:l，入一 HindIITdigest;2，長雙歧桿菌叢因組DNA Figure2.1PatternofeleetroPhoresisofgenornieDNAofB.long:‘mNote:1，，入一 Hind111digest:2， GenomieDNAofB.long:一nZ實驗表明，基因組DNA的大小約為 23000bp，其提取效果較好，無明顯的降解現(xiàn)象
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圖片說明： 23222027圖2.1基因組ONA電泳圖譜入一HindIITdigest;2，長雙歧桿菌叢因組DNAernofeleetroPhoresisofgenornieDNAofB.long一Hind111digest:2，GenomieDNAofB.long:一nZNA的大小約為23000bp，其提取效果較驗。增WBLO01(B.tongllnZWBLO01)中發(fā)現(xiàn)b了基因，其PCR擴增結(jié)果如圖2.2所皿ATGACAGTI…AAGATTGGTATCAACG送邏TCACTCGGAGATCTCAGCGA一3
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R371

【參考文獻】

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本文編號：2514916