【摘要】：【研究背景】周圍神經(jīng)缺損后移植修復(fù)常以犧牲供區(qū)神經(jīng)為代價,以雪旺細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程神經(jīng)研究為周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)帶來新選擇,卻同樣不可避免損傷另一條神經(jīng)。避開胚胎干細(xì)胞的倫理學(xué)障礙,誘導(dǎo)成體干細(xì)胞分化為類雪旺細(xì)胞(Schwann cell-like cell lineages,SCs-like)進(jìn)行組織工程神經(jīng)研究,正受到廣泛關(guān)注。肌源性干細(xì)胞(muscle-derived stem cells,MDSCs)是一類新近發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞,具有干細(xì)胞的一般特性。肌源性干細(xì)胞多系統(tǒng)分化潛能表現(xiàn)為經(jīng)誘導(dǎo)可分化為骨、軟骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等,自我更新能力表現(xiàn)為經(jīng)過30次傳代培養(yǎng)后能保持初始的細(xì)胞表型及基因組構(gòu)成。具有移植免疫優(yōu)越性是肌源性干細(xì)胞的獨(dú)特優(yōu)勢。肌源性干細(xì)胞日益被應(yīng)用到骨骼、肌肉等組織的再生醫(yī)學(xué)研究中,已有動物體內(nèi)實(shí)驗研究表明MDSCs能促進(jìn)肌纖維的再生、增強(qiáng)再生肌組織的功能,并能少量分化為神經(jīng)外膜組織和具有雪旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)表型的細(xì)胞。后者為組織工程神經(jīng)研究尋找新的類雪旺細(xì)胞作為種子細(xì)胞帶來可能。近年人源肌源干細(xì)胞(human muscle-derived stem cells,h-MDSCs)的成功分離拉近了肌源干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用之間的距離。 【目的】(1)掌握顯微鏡下小鼠肌組織分離和肌源干細(xì)胞分離過程中三重酶消化和細(xì)胞篩過濾方法,應(yīng)用改良的差速貼壁法從小鼠肌組織分離得到肌源干細(xì)胞,應(yīng)用有限稀釋技術(shù)培養(yǎng)肌源干細(xì)胞單細(xì)胞克隆和亞克隆集落;(2)從重瞼成形術(shù)廢棄的組織中尋找可供利用的健康肌組織,并分析其作為科學(xué)研究用途的合理性;(3)借鑒小鼠肌源干細(xì)胞分離方法,建立從人眼輪匝肌組織分離人源肌源干細(xì)胞的方法,為人成體干細(xì)胞的研究提供新的組織分離來源,并分析其獲取方法從“微創(chuàng)”到“無創(chuàng)”的進(jìn)步;(4)從大鼠坐骨神經(jīng)獲取雪旺細(xì)胞進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng),制備雪旺細(xì)胞條件培養(yǎng)液;(5)將人源肌源干細(xì)胞與雪旺細(xì)胞條件培液共培養(yǎng),誘導(dǎo)人源肌源干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞方向分化,為組織工程神經(jīng)研究尋找可能的種子細(xì)胞替代物。 【方法】(1)顯微鏡下依次剝離骨、軟骨和神經(jīng)血管組織,獲得較為單一的小鼠肌組織;經(jīng)過膠原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三重消化,繼以100目、200目和400目細(xì)胞篩過濾,得到富含肌源干細(xì)胞的細(xì)胞懸液;通過改良差速貼壁法的首次貼壁時間為1小時,分離和培養(yǎng)小鼠肌源干細(xì)胞,相差顯微鏡下觀察歷次貼壁細(xì)胞和肌源干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài);通過有限稀釋技術(shù)培養(yǎng)肌源干細(xì)胞單細(xì)胞克隆和亞克隆集落,描繪細(xì)胞克隆生長曲線;應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法標(biāo)記肌源干細(xì)胞表面Desmin和Sca-1,鑒定其細(xì)胞來源和表面干細(xì)胞特異標(biāo)記物;(2)2010年7月至2010年11月間,選擇三名行重瞼成形術(shù)的女性患者作為志愿者(年齡19-24周歲)。志愿者在第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院整形外科接受切開法重瞼成形術(shù)后,收集志愿者提供的眼輪匝肌,進(jìn)行數(shù)據(jù)測量并轉(zhuǎn)移至實(shí)驗室。通過與獲取人體健康組織的常見方法比較,分析重瞼成形術(shù)中獲取眼輪匝肌作為研究對象的合理性;(3)借鑒小鼠肌源干細(xì)胞分離方法,鏡下依次去除附著于肌組織的筋膜組織和神經(jīng)血管組織,獲得較為單一的眼輪匝肌組織;經(jīng)膠原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三重消化,繼以100目、200目和400目細(xì)胞篩過濾,得到富含人源肌源干細(xì)胞的細(xì)胞懸液;通過差速貼壁去除成纖維細(xì)胞,分離和培養(yǎng)人源肌源干細(xì)胞,相差顯微鏡下觀察人源肌源干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài);應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法鑒定人源肌源干細(xì)胞表面Desmin和Sca-1,鑒定其細(xì)胞來源和表面干細(xì)胞特異標(biāo)記物;通過與人成體干細(xì)胞常見分離方法的比較,分析該方法“無創(chuàng)”的優(yōu)越性;(4)獲取新生大鼠坐骨神經(jīng),顯微鏡下去除神經(jīng)外膜,胰蛋白酶消化后,進(jìn)行雪旺細(xì)胞的的原代和傳代細(xì)胞培養(yǎng),通過免疫組織化學(xué)染色法鑒定雪旺細(xì)胞并分析細(xì)胞純度;通過半量換液,收集雪旺細(xì)胞條件培液;(5)通過與雪旺細(xì)胞條件培液共培養(yǎng),誘導(dǎo)人源肌源干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞方向分化,相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),免疫組織化學(xué)染色法標(biāo)記誘導(dǎo)分化后細(xì)胞表面的雪旺細(xì)胞特異標(biāo)記物S100,GFAP和p75。 【結(jié)果】(1)通過應(yīng)用改良的差速貼壁法和有限稀釋技術(shù),從小鼠肌組織成功分離培養(yǎng)出肌源干細(xì)胞,光鏡下觀察細(xì)胞呈現(xiàn)典型的短梭形和小圓形形態(tài)特征,呈現(xiàn)集落樣生長,增殖速度快,未發(fā)生分化。免疫組織化學(xué)染色顯示細(xì)胞均呈現(xiàn)Desmin陽性染色,Sca-1陽性染色,Sca-1陽性率為92.3±4.1%;(2)收集三名接受重瞼成形術(shù)的患者志愿提供的雙側(cè)上瞼眼輪匝肌共6條,雙側(cè)眼輪匝肌濕重合計156-241mg之間,達(dá)到分離細(xì)胞所需的組織量;(3)從眼輪匝肌中分離和培養(yǎng)人源肌源干細(xì)胞,光鏡下觀察細(xì)胞呈現(xiàn)典型的短梭形和小圓形形態(tài)特征,增殖速度快,未發(fā)生分化。免疫組織化學(xué)染色顯示細(xì)胞均呈現(xiàn)Desmin陽性染色,Sca-1陽性染色,Sca-1陽性率為81.8±2.4%;(4)成功分離大鼠坐骨神經(jīng)來源的雪旺細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng),免疫組織化學(xué)染色法標(biāo)記雪旺細(xì)胞表面S100蛋白,顯示S100染色陽性,陽性率為97.4±0.7%;通過半量換液,制備雪旺細(xì)胞條件培液;(5)成功誘導(dǎo)人源肌源干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞方向分化,免疫組織化學(xué)染色法標(biāo)記分化后類雪旺細(xì)胞表面特異標(biāo)記物S100,GFAP和p75,染色結(jié)果顯示陽性,陽性率分別為65.1±3.4%,23.3±1.7%和30.3±5.2%。 【結(jié)論】(1)應(yīng)用改良的差速貼壁法,可從小鼠肌組織中分離得到肌源干細(xì)胞;(2)借鑒小鼠肌源干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法,可從人眼輪匝肌分離得到人源肌源干細(xì)胞,增加了肌源干細(xì)胞的分離來源,為人源成體干細(xì)胞的研究提供了新的細(xì)胞來源;(3)應(yīng)用雪旺細(xì)胞條件培液可誘導(dǎo)人源肌源干細(xì)胞分化為類雪旺細(xì)胞,為組織工程神經(jīng)研究尋找到新的種子細(xì)胞替代物;(4)諸如重瞼成形術(shù)等美容整形手術(shù)可為組織工程和再生醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究和潛在臨床應(yīng)用提供更為合理的人體健康組織和成體干細(xì)胞來源。
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圖片說明： 第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文圖1-1 相差顯微鏡下MDSCs分離過程中貼壁的pp1-pp5細(xì)胞貼壁細(xì)胞生長一周時形態(tài)記錄。圖A，B，C 為 pp1 貼壁生長一周后不同倍數(shù)下的形態(tài)記錄，依次至圖 M，N，O 為 pp5。pp1 約半數(shù)以上細(xì)胞為不規(guī)則的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞（圖 A），一周時成熟肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，可見明顯增大的細(xì)胞核（圖 C），pp2、pp3 和 pp4 除少量細(xì)胞外均為肌性來源
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圖片說明： 圖 1-4 相差顯微鏡下培養(yǎng) 2 周的 MDSCs、MDSC 單克隆和 MDSCs 亞克隆生長狀態(tài)和細(xì)胞形態(tài)特征。圖 A 示兩個相鄰 MDSCs 集落，集落之間分界明顯；圖 D 和圖 G 分別為 MDSC 單細(xì)胞克隆集落和亞克隆集落。圖 F，I 示 MDSC 克隆集落細(xì)胞多數(shù)呈小圓形，折光性強(qiáng)，少量呈短梭形，未出現(xiàn)向成熟肌細(xì)胞分化的狀態(tài)。(A，D，G；bar=200um；B，E，H；bar=100um；C，F(xiàn)，I；bar=50um.)圖 1-5 MDSC 單克隆細(xì)胞 Desmin/Sca-1 免疫組織化學(xué)染色。MDSC 單克隆細(xì)胞均呈現(xiàn) Desmin 染色陽性（綠色，圖 A），Sca-1 染色陽性（紅色，圖 B），Sca-1 陽性率為 92.3±4.1%；圖 C 示 Desmin/Sca-1共標(biāo)。陰性對照組無陽性標(biāo)記。(A，B，C； bar=33um)26
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2514527