【摘要】：目的構(gòu)建以濟(jì)南本土分離株為模板的EV71感染性克隆,轉(zhuǎn)染細(xì)胞以獲得拯救病毒并觀察其生物學(xué)特性,為研究EV71病毒基因結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。方法分段擴(kuò)增EV71基因組cDNA并順序連接至pCDNA3.1載體,同時(shí)在序列兩端引入自剪切核酶序列,構(gòu)建能直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞的病毒基因組全長(zhǎng)cDNA克隆,轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞后獲得拯救病毒。通過(guò)噬斑形成試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)和感染性滴度測(cè)定觀察拯救病毒的生物學(xué)特征。結(jié)果成功構(gòu)建了病毒基因組全長(zhǎng)cDNA克隆,轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞后觀察到典型細(xì)胞病變,收獲的病毒經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出特異性目的片段,全序列測(cè)定結(jié)果表明拯救病毒與父本株相比具有3個(gè)同義突變,未導(dǎo)致推導(dǎo)氨基酸的變異;拯救的子代病毒感染RD細(xì)胞后形成典型的空斑;間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)拯救病毒感染細(xì)胞可見(jiàn)特異性熒光,熒光密度較父本株病毒稍弱;拯救病毒傳代穩(wěn)定,其感染性滴度(10-3.48)較父本株(10-5.0)稍低。結(jié)論成功構(gòu)建了真核載體的病毒全長(zhǎng)cDNA感染性克隆,拯救病毒與野生株具有相似的生物學(xué)性狀和感染性。
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圖片說(shuō)明： 目的基因序列與ＪＮ２００８０４株完全相同，５＇端和３＇端成功引入限制性酶切位點(diǎn)和核酶序列，同時(shí)３＇端成功引入２５個(gè)Ａ的ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴。２細(xì)胞轉(zhuǎn)染克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ＲＤ細(xì)胞后７２ｈ，可見(jiàn)到典型的ＣＰＥ。ＣＰＥ逐日增多，５ｄ后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清以２０％比例傳代，，第３ｄ病變達(dá)到７５％以上（圖１－Ｂ）。對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)３ｄ時(shí)均仍保持正常形態(tài)（圖１－Ａ）。Ａ正常對(duì)照細(xì)胞（３ｄ）ＢｃＤＮＡ克隆轉(zhuǎn)染ＲＤ細(xì)胞（３ｄ）圖１ｃＤＮＡ克隆轉(zhuǎn)染ＲＤ細(xì)胞病變（１００×）ＡＣｏｎｔｒｏｌｃｅｌｌｓＢＣｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＦｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡＦｉｇ．１ＣｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎＲＤｃｅｌｌｓ（１００×）３拯救病毒鑒定采用ＥＶ７１特異性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物對(duì)拯救病毒感染細(xì)胞ＲＮＡ進(jìn)行ＲＴ－ＰＣＲ，得到約２２６ｂｐ的擴(kuò)增片段，大小與預(yù)期一致（圖２）。將拯救子代病毒進(jìn)行全序列測(cè)定，并與ＪＮ２００８０４株進(jìn)行全序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有３個(gè)堿基發(fā)生變異，分別位于４３８６、５１８４和７１６７ｂｐ，均為同義突變，未導(dǎo)致推導(dǎo)氨基酸的變異。１拯救病毒ＲＴ－ＰＣＲ產(chǎn)物ＭＤＮＡ標(biāo)志物圖２拯救病毒ＲＴ－ＰＣＲ鑒定１ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｒｅｓｃｕｅｄｖｉｒｕｓＭＤＮＡＭａｒｋｅｒＦｉｇ．２Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｃｕｅｄｖｉｒｕｓ４噬斑形成試驗(yàn)拯救的子代病毒和ＪＮ２００８０４株感染ＲＤ細(xì)胞后均可形成明顯的空斑，其形態(tài)典型，大小均一。但子代病毒與父本株相
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圖片說(shuō)明： 時(shí)均仍保持正常形態(tài)（圖１－Ａ）。Ａ正常對(duì)照細(xì)胞（３ｄ）ＢｃＤＮＡ克隆轉(zhuǎn)染ＲＤ細(xì)胞（３ｄ）圖１ｃＤＮＡ克隆轉(zhuǎn)染ＲＤ細(xì)胞病變（１００×）ＡＣｏｎｔｒｏｌｃｅｌｌｓＢＣｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＦｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡＦｉｇ．１ＣｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎＲＤｃｅｌｌｓ（１００×）３拯救病毒鑒定采用ＥＶ７１特異性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物對(duì)拯救病毒感染細(xì)胞ＲＮＡ進(jìn)行ＲＴ－ＰＣＲ，得到約２２６ｂｐ的擴(kuò)增片段，大小與預(yù)期一致（圖２）。將拯救子代病毒進(jìn)行全序列測(cè)定，并與ＪＮ２００８０４株進(jìn)行全序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有３個(gè)堿基發(fā)生變異，分別位于４３８６、５１８４和７１６７ｂｐ，均為同義突變，未導(dǎo)致推導(dǎo)氨基酸的變異。１拯救病毒ＲＴ－ＰＣＲ產(chǎn)物ＭＤＮＡ標(biāo)志物圖２拯救病毒ＲＴ－ＰＣＲ鑒定１ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｒｅｓｃｕｅｄｖｉｒｕｓＭＤＮＡＭａｒｋｅｒＦｉｇ．２Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｃｕｅｄｖｉｒｕｓ４噬斑形成試驗(yàn)拯救的子代病毒和ＪＮ２００８０４株感染ＲＤ細(xì)胞后均可形成明顯的空斑，其形態(tài)典型，大小均一。但子代病毒與父本株相比噬斑邊緣較圓滑，平均直徑稍�。▓D３）。５間接免疫熒光試驗(yàn)拯救病毒傳代后以ＥＶ７１單克隆抗體為一抗，熒光素標(biāo)記羊抗鼠ＩｇＧ為二抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，可見(jiàn)到特異性熒光，熒光密度較ＪＮ２００８０４株病毒稍弱（圖４－Ｃ）。ＪＮ２００８０４株病毒感染細(xì)胞可見(jiàn)熒光，而細(xì)胞對(duì)照無(wú)熒光產(chǎn)生（圖４－Ｂ、Ａ）。表明拯救子代病毒具有感染性。６病毒感染性滴
【作者單位】： 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所山東省罕少見(jiàn)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(No.31500050) 山東省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(No.ZR2013HQ039) 山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2015WS0195) 山東省醫(yī)科院院級(jí)課題面上項(xiàng)目(No.2015-27)
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2514444