發(fā)布時間：2019-07-13 10:17

【摘要】：目的：使用生物降解水凝膠P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)作為載體的防齲基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT經(jīng)股四頭肌注射、頜下腺周注射、鼻粘膜滴注及口服四種不同途徑免疫SD大鼠,觀察免疫效果,探索水凝膠作為防齲疫苗緩釋系統(tǒng)的體系組成及應(yīng)用。 方法：本研究包括三個部分： 實(shí)驗(yàn)一：重組質(zhì)粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT及空載體質(zhì)粒pVAZX1的鑒定和大量制備。先小量抽提重組質(zhì)粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT及空載體質(zhì)粒pVAX1。并經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、凝膠電泳鑒定。在鑒定正確后,大量抽提重組質(zhì)粒并計算其濃度和純度,保存以備免疫動物。 實(shí)驗(yàn)二：溫敏型生物降解水凝膠P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)表面形態(tài)的掃描電鏡(SEM)觀察,并對其溫敏性進(jìn)行檢測和防齲基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT在以水凝膠P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)為載體條件下的體外釋放研究。實(shí)驗(yàn)三：生物降解水凝膠P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)作為載體的重組質(zhì)粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT及空載體質(zhì)粒pVAX1免疫SD大鼠。出生21天的雄性SD大鼠90只,隨機(jī)分為15組：A組:pVAX1-spap/A股四頭肌注射組；B組：pVAX1-spap/A頜下腺注射組；C組：pVAX1-spap/A鼻腔滴注組;D組：pVAX1-spap/A口服組；E組：pVAX1-gtfB/CAT股四頭肌注射組;F組：pVAX1-gtfB/CAT頜下腺注射組；G組：pVAX1-gtfB/CAT鼻腔滴注組；H組：pVAX1-gtfB/CAT口服組；I組：pVAX1-spap/A-gtfB/CAT股四頭肌注射組；J組：pVAX1-spap/A-gtfB/CAT頜下腺注射組；K組：pVAX1-spap/A-gtfB/CAT鼻腔滴注組;L組：pVAX1-spap/A-gtfB/CAT口服組；M組(陰性對照組)：空載質(zhì)粒pVAX1股四頭肌注射組；N組(陰性對照組)：空載質(zhì)粒pVAX1+水凝膠口服組；O組(空白對照組)：生理鹽水股四頭肌注射組；建立齲齒模型；每只SD大鼠按照確定的免疫途徑進(jìn)行免疫,每次劑量為100μg/只,股四頭肌注射組、頜下腺注射組和鼻腔滴注組每側(cè)各50μg,對照組M、N、O組遵循上述劑量,第28天開始免疫,每周一次,連續(xù)免疫三周；樣本采集從免疫開始前一天開始,每周采集一次；處死動物后,稱重,解剖分離其心、肝、脾、肺、腎、股四頭肌、頜下腺、胃等臟器,進(jìn)行病理檢查；取上下頜骨,進(jìn)行齲損評定,根據(jù)Keyes經(jīng)典評分方法進(jìn)行評估；采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(間接ELISA法)檢測血液和唾液中IgG和S-IgA抗體水平。 結(jié)果：①使用試劑盒抽提出符合實(shí)驗(yàn)要求的重組質(zhì)粒pVAXl-spap/A, pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT及空載體質(zhì)粒pVAX1。②生物降解水凝膠P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)在37℃發(fā)生溶液相-凝膠相轉(zhuǎn)變。重組質(zhì)粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT能夠在水凝膠P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)為緩釋系統(tǒng)的體系中緩慢釋放。③以生物降解水凝膠P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)為載體的重組質(zhì)粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT緩釋系統(tǒng)在免疫SD大鼠后,可以誘導(dǎo)S-IgA型特異性抗體和IgG型特異性抗體均明顯升高,并持續(xù)數(shù)周。④實(shí)驗(yàn)組與對照組相比,齲損明顯降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：①本實(shí)驗(yàn)證明溫敏型生物降解水凝膠P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)具有溫度敏感性,在37℃時發(fā)生溶液相—凝膠相的轉(zhuǎn)變；②防齲基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT和pVAX1-spap/A-gtfB/CAT在水凝膠作為緩釋系統(tǒng)的條件下,可以有效地減緩質(zhì)粒DNA的釋放,起到緩釋作用；③防齲基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAXl-spap/A-gtfB/CAT在水凝膠作為緩釋系統(tǒng)的條件下,能誘導(dǎo)SD大鼠的血液和唾液中特異性抗體的產(chǎn)生,抑制大鼠齲齒的發(fā)生。
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圖片說明： 3.2.2重組質(zhì)粒pvAxl一gt扭/cAT雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pVAXI一gt侶/CAT經(jīng)柳nI/Eco川雙酶切為 3.okb和500bp的兩個月‘段(見圖1一2)。片段 500bp與 gtm/CAT基因片段大小相同。圖1一2玉纖{質(zhì)粒pVAx卜gtfB/CAT的酶切鑒定Fig.l一 2ThemaPofthereeombinantPlasmidPVAXI一gtfB/CAI， wasldelltified1:KPlll/Ec0RI雙酶切后的pV入xl一gtfB/cATMI:DL一 2000MarkerMZ:補(bǔ) EeoT141digestMarker 3.2.3重組質(zhì)粒pvAxl一sPaP/A一gt扭/CAT雙酶切鑒定幣全!1一質(zhì)粒pVAXI一spap/A一gt侶/CAT經(jīng)Kpnl/EeoRI雙酶切為3.Okb不 !}1.skb的I月J個片段見(l冬11一3)。片段1.skb’、spap/A一gt伯/cAT從因片段人小相同。
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