【摘要】：紅細(xì)胞在人體內(nèi)的生命周期只有120天左右,延長紅細(xì)胞壽命對(duì)于臨床輸血及充分利用血液資源都具有重要的意義。由CD47-SIRPα信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與的非調(diào)理性吞噬過程對(duì)紅細(xì)胞老化吞噬有著重要作用。目前,國外針對(duì)此信號(hào)系統(tǒng)的研究已取得了一些重要成果。但是,這些重要發(fā)現(xiàn)主要是針對(duì)動(dòng)物模型(鼠類紅細(xì)胞)。本文的主要目的在于從人類紅細(xì)胞的角度出發(fā),研究人類紅細(xì)胞老化與吞噬過程中,紅細(xì)胞膜蛋白的變化以及CD47-SIRPα信號(hào)通路的作用。 首先,通過4℃C、37℃C體外保存及毛細(xì)管離心法三種不同老化途徑中制備不同年齡的紅細(xì)胞,抽取紅細(xì)胞膜蛋白及囊泡,采用Western blot的方法檢測不同老化途徑的不同年齡紅細(xì)胞的膜蛋白上CD47、GPA及囊泡上CD47、GPA量的變化,并采用流式細(xì)胞術(shù)的方法對(duì)4℃體外保存不同年齡紅細(xì)胞膜上CD47、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(CD35、CD55、CD59)量的變化進(jìn)行檢測,以核實(shí)Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 經(jīng)Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn),4℃體外保存紅細(xì)胞膜上CD47及GPA的量隨著保存時(shí)間的延長均出現(xiàn)下降的趨勢,其中CD47的表達(dá)量最大可下降82.64%。同樣的37℃體外保存紅細(xì)胞膜上CD47的表達(dá)量最大可下降84.51%。毛細(xì)管離心法分離的年輕和年老紅細(xì)胞膜上,CD47表達(dá)量最大可下降36.6%。流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果與Western blot方法檢測結(jié)果相一致。另外,我們還采用Western blot方法檢測囊泡上CD47及GPA量。發(fā)現(xiàn),4℃體外保存情況下,抽提的囊泡上CD47及GPA的蛋白含量均出現(xiàn)不同程度的增多,保存40天的血樣抽提的囊泡上CD47的量是保存10天囊泡上量的3倍。這些結(jié)果均表明,在紅細(xì)胞的老化過程中,紅細(xì)胞表面的膜蛋白量均以囊泡的形式不斷丟失、減少。 用體外培養(yǎng)人單核白血病細(xì)胞(THP-1),吞噬IgG抗-D致敏紅細(xì)胞、毛細(xì)管分離的年輕和年老紅細(xì)胞及CD47抗體F(ab’)2端封閉紅細(xì)胞,并進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色,觀察THP-1細(xì)胞對(duì)不同處理紅細(xì)胞的吞噬情況。在此基礎(chǔ)上,我們采用免疫沉淀方法,抽提吞噬了不同年齡紅細(xì)胞后THP-1細(xì)胞上的總酪氨酸磷酸化蛋白,并通過Western blot技術(shù)檢測抽提蛋白中磷酸化SIRPα的量,比較吞噬不同年齡紅細(xì)胞后THP-1上磷酸化SIRPα量的變化。 經(jīng)單核細(xì)胞單層分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),THP-1細(xì)胞更傾向于吞噬年老紅細(xì)胞,吞噬率為35.32%,而對(duì)年輕紅細(xì)胞的吞噬率僅為13.72%(n=7,P0.02)；對(duì)新鮮紅細(xì)胞的吞噬率為2.22%,對(duì)CD47抗體F(ab’)2端封閉紅細(xì)胞的吞噬率則為31.51%(n=7,P0.02)；并且,吞噬不同年齡紅細(xì)胞后,THP-1細(xì)胞上磷酸化SIRPα量不同。與吞噬年輕紅細(xì)胞相比,吞噬年老紅細(xì)胞后,磷酸化SIRPα的量下降了57.12%。提示CD47-SIRPα抑制信號(hào)的下調(diào)導(dǎo)致吞噬信號(hào)的相對(duì)增強(qiáng)是紅細(xì)胞老化的重要因素。表明人類紅細(xì)胞的老化與吞噬過程和CD47-SIRPα相互作用存在密切關(guān)系。 與此同時(shí),在紅細(xì)胞的老化與吞噬過程中,除了存在CD47-SIRPα非調(diào)理性吞噬途徑外,還存在由補(bǔ)體和抗體參與的調(diào)理性吞噬過程。為了探究紅細(xì)胞膜上補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在紅細(xì)胞調(diào)理性吞噬過程中的作用,我們主要通過甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酸酯(mPEG-SPA)及抗體F(ab’)2端封閉紅細(xì)胞表面補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的方式來觀察補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的作用。流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)結(jié)果表明,4℃體外保存紅細(xì)胞上,隨著紅細(xì)胞的老化,補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD35、CD55、CD59均出現(xiàn)不同程度的下降,CD35表達(dá)量的最大可下降75.5%,CD55的最大下降量為66.93%,CD59為54.23%,說明這些蛋白在紅細(xì)胞老化過程中確實(shí)存在某些作用,但是其具體作用以及紅細(xì)胞非調(diào)理性吞噬與調(diào)理性吞噬間的關(guān)系,仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2513910