發(fā)布時(shí)間：2017-03-16 02:01

  本文關(guān)鍵詞：E3泛素化酶siah-1核聚集在同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的明確高同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制,探討核內(nèi)siah-1聚集在此凋亡過程中所起機(jī)制的研究。方法(1)用不同濃度同型半胱氨酸(Hcy)培養(yǎng)C6細(xì)胞,模擬高同型半胱氨酸損傷細(xì)胞模型,觀察Hcy處理后細(xì)胞活力變化,CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞增值率,選定干預(yù)濃度;(2)TUNEL法檢測正常組與同型半胱氨酸處理組細(xì)胞凋亡程度;(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)技術(shù)測定同型半胱氨酸對C6細(xì)胞內(nèi)siah-1基因、GAPDH基因的m RNA表達(dá);蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測siah-1、GAPDH蛋白表達(dá)水平的影響;(4)使用免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察同型半胱氨酸處理細(xì)胞后胞內(nèi)siah-1及GAPDH的分布和亞細(xì)胞定位改變;(5)用siah-1-si RNA干擾細(xì)胞后,real-time PCR及Western blot檢測干擾效率;(6)觀察siah-1干擾后正常組與同型半胱氨酸處理組細(xì)胞核內(nèi)GAPDH蛋白表達(dá)影響,免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡明確siah-1干擾對GAPDH核轉(zhuǎn)位改變。(7)觀察siah-1干擾后正常組與同型半胱氨酸處理組細(xì)胞內(nèi)P53及caspase 3表達(dá)的影響。結(jié)果(1)CCK-8檢測細(xì)胞增殖率發(fā)現(xiàn),同型半胱氨酸處理C6細(xì)胞48小時(shí)后,細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制,且隨著同型半胱氨酸濃度增加,細(xì)胞增殖能力逐漸下降;(2)TUNEL染色發(fā)現(xiàn):正常組細(xì)胞TUNEL陽性染色極少,而同型半胱氨酸處理組細(xì)胞TUNEL染色陽性明顯增加,提示一定濃度的同型半胱氨酸可促進(jìn)C6細(xì)胞凋亡。(3)Real-time PCR結(jié)果顯示:同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞48小時(shí)后,與對照組相比,Hcy處理組細(xì)胞內(nèi)siah-1、GAPDH m RNA表達(dá)明顯增加,且隨著同型半胱氨酸濃度增加而增加,呈濃度依賴性;(4)Western blot結(jié)果提示:同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞48小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)siah-1、GAPDH蛋白表達(dá)也明顯增加,同樣隨著同型半胱氨酸濃度增加而增加,呈濃度依賴性;(5)免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常組細(xì)胞siah-1及GAPDH主要在細(xì)胞漿表達(dá),細(xì)胞核少有或者無表達(dá),而同型半胱氨酸處理組細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)siah-1及GAPDH聚集現(xiàn)象;(6)用si RNA干擾后,可有效抑制細(xì)胞內(nèi)siah-1 m RNA和蛋白水平的表達(dá);激光共聚焦熒光顯微鏡結(jié)果顯示,干擾siah-1的表達(dá)可減少同型半胱氨酸所致的GAPDH的聚集及核轉(zhuǎn)位。提示了siah-1參與了同型半胱氨酸誘導(dǎo)的GAPDH核轉(zhuǎn)位,形成siah-1/GAPDH復(fù)合物后,由胞漿向胞核發(fā)生轉(zhuǎn)位,發(fā)揮促凋亡作用。結(jié)論同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞后可誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)siah-1、GAPDH表達(dá)增加,發(fā)生由細(xì)胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位;干擾siah-1后,可以減少同型半胱氨酸所致核內(nèi)siah-1及GADPH聚集現(xiàn)象。提示了siah-1參與了GAPDH由胞漿向胞核轉(zhuǎn)位的運(yùn)動機(jī)制,同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞后促進(jìn)siah-1/GAPDH復(fù)合物的形成,并從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核,形成核內(nèi)聚集,最后發(fā)生細(xì)胞凋亡,而對siah-1進(jìn)行干擾可能抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡作用。
【關(guān)鍵詞】：同型半胱氨酸 siah-1 GAPDH 凋亡
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 中英文縮略詞表（ABBREVIATION）9-10
• 1 引言10-12
• 2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容12-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料12-15
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞12
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑12-13
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)用液13-15
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器15
• 2.2 引物、SIRNA設(shè)計(jì)與合成15-16
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法16-24
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析24
• 2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-35
• 3 討論35-40
• 4 結(jié)論40
• 參考文獻(xiàn)40-45
• 附錄45-46
• 致謝46-47
• 綜述47-53
• 參考文獻(xiàn)52-53

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 田香珠;E3泛素化酶siah-1核聚集在同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：E3泛素化酶siah-1核聚集在同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：251203