本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)錄抑制因子SirR參與脅迫應(yīng)答和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)仍然威脅著全球人類的健康,2014年新增感染病例900萬,150萬人死于結(jié)核病,成為僅次于艾滋病的全球第二大傳染疾病(http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/)。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起結(jié)核病的病原菌,它能夠在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)持留,持留結(jié)核分枝桿菌可以逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷作用以及抗結(jié)核藥物。近年來,由于多重耐藥(multidrug-resistant,MDR)、廣泛耐藥(extensively drug-resistant,XDR)甚至是完全耐藥(totally drug resistant tuberculosis,TDR)MTB的出現(xiàn),MTB與HIV共感染增加,再加上缺乏抗結(jié)核新藥和疫苗,結(jié)核病形勢變得更加嚴(yán)峻。因此,對于結(jié)核分枝桿菌致病機(jī)理的研究迫在眉睫。結(jié)核分枝桿菌能夠通過多種機(jī)制逃逸宿主免疫系統(tǒng)的殺傷,適應(yīng)不利環(huán)境。除了細(xì)胞壁含有獨(dú)特的蠟質(zhì)分枝菌酸,具有高度不透性,以及多種外排泵之外,結(jié)核分枝桿菌具有復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。金屬調(diào)控蛋白通過控制細(xì)菌中與金屬離子吸收,儲存和外排相關(guān)基因的表達(dá),從而維持細(xì)菌金屬離子代謝的穩(wěn)定,其中DtxR(diphtheria toxin repressor)家族是最具有代表性的金屬調(diào)控蛋白之一。結(jié)核分枝桿菌中,DtxR家族包括兩個成員:IdeR(iron dependent repressor)和SirR(iron repressor),本課題主要以SirR為研究對象開展實(shí)驗(yàn)。SirR最初發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌,作為轉(zhuǎn)錄抑制因子,控制毒力基因的表達(dá)。結(jié)核分枝桿菌中,SirR由Rv2788編碼,由于SirR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控依賴錳離子,并且調(diào)控與錳離子吸收相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,被重命名為MntR。為了研究Rv2788蛋白在脅迫應(yīng)答中的作用,我們分別構(gòu)建了能夠表達(dá)Rv2788蛋白的重組恥垢分枝桿菌(Ms_Rv2788)以及空載體重組恥垢分枝桿菌(Ms_Vec)。研究發(fā)現(xiàn),Rv2788蛋白沒有影響重組恥垢分枝桿菌的生長速率,但改變了菌落形態(tài)。通過體外模擬恥垢分枝桿菌侵染巨噬細(xì)胞時面臨的壓力條件,發(fā)現(xiàn)Rv2788增強(qiáng)重組恥垢分枝桿菌的抗壓能力,對雙氧水、聯(lián)氨氧化壓力,SDS表面活性劑和酸性壓力更加耐受,同時增強(qiáng)了氯霉素、萬古霉素和阿米卡星處理后的存活能力。GC-MS分析細(xì)胞壁的脂肪酸組分,發(fā)現(xiàn)重組菌Ms_Rv2788的脂肪酸成分明顯上調(diào),特別是C14:1w5(t),C14:0和C16:1w7(c)。通過檢測溴化乙錠和尼羅紅的積累,發(fā)現(xiàn)Rv2788蛋白降低了重組恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁的通透性。這說明Ms_Rv2788可能通過改變細(xì)胞壁的脂肪酸組分降低細(xì)胞壁的通透性,進(jìn)而增強(qiáng)對環(huán)境壓力以及抗生素的耐受能力。但是,我們發(fā)現(xiàn)了一個特殊現(xiàn)象:與空載菌相比,重組菌Ms_Rv2788對卷曲霉素更加敏感。熒光定量PCR檢測與卷曲霉素耐受相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)Rv0039,Rv0812,Rv1286三個基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào),這表明Rv2788調(diào)控卷曲霉素耐受相關(guān)基因增強(qiáng)了恥垢分枝桿菌對卷曲霉素的敏感性。此外,熒光定量PCR檢測了Rv2788的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用可能調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)whiB1,Rv0077,Rv2221,Rv2986和Rv1219五個基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),而SOS反應(yīng)相關(guān)基因lexA則明顯上調(diào)表達(dá)。通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測到Rv2788能夠與上述下調(diào)基因的啟動子片段結(jié)合,這說明Rv2788直接調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄水平。綜上所述,本文主要研究了轉(zhuǎn)錄抑制因子Rv2788在壓力脅迫和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮的功能,首次報道了Rv2788可能直接或間接參與分枝桿菌脂肪酸代謝,改變細(xì)胞壁的脂肪酸成分和菌落形態(tài),降低細(xì)胞壁的通透性,增強(qiáng)恥垢分枝桿菌的抗壓能力;調(diào)控卷曲霉素耐受相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對卷曲霉素的敏感性;負(fù)調(diào)控多個基因,包括與細(xì)胞壁合成相關(guān)的基因whiB1和lexA。然而,Rv2788蛋白改變分枝桿菌細(xì)胞壁脂肪酸組分和細(xì)胞壁的通透性的分子機(jī)制,以及下調(diào)基因與脅迫應(yīng)答之間的的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 SirR 脅迫應(yīng)答 細(xì)胞壁 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第1章 綜述10-17
• 1.1 前言10
• 1.2 細(xì)菌中鐵離子依賴的調(diào)控作用10-11
• 1.3 鐵離子調(diào)控在感染中的作用11
• 1.4 分枝桿菌中鐵離子的調(diào)控11-12
• 1.5 結(jié)核分枝桿菌的金屬依賴調(diào)控蛋白FurA和FurB12-13
• 1.6 IdeR蛋白13-16
• 1.6.1 IdeR與鐵離子代謝調(diào)控13-15
• 1.6.2 IdeR與分枝桿菌氧化應(yīng)激反應(yīng)15
• 1.6.3 IdeR與活性氮氧化壓力15-16
• 1.7 SirR蛋白16
• 1.8 總結(jié)16-17
• 第2章 引言17-19
• 第3章 實(shí)驗(yàn)材料和方法19-34
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料19-22
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒19
• 3.1.2 主要試劑和溶液19-21
• 3.1.3 主要培養(yǎng)基21-22
• 3.1.4 主要儀器22
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法22-34
• 3.2.1 構(gòu)建表達(dá)Rv2788基因的重組恥垢分枝桿菌22-27
• 3.2.2 Rv2788基因在大腸桿菌中的克隆表達(dá)與純化27-28
• 3.2.3 生長曲線的測定28
• 3.2.4 菌落形態(tài)觀察和滑動實(shí)驗(yàn)28-29
• 3.2.5 體外分析重組恥垢分枝桿菌在不同壓力脅迫下的生存能力29
• 3.2.6 重組恥垢分枝桿菌對抗結(jié)核藥物耐藥性分析29-30
• 3.2.7 重組恥垢分枝桿菌脂肪酸的測定30-31
• 3.2.8 重組恥垢分枝桿菌對溴化乙錠和尼羅紅的吸收分析31
• 3.2.9 Rv2788的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析31-32
• 3.2.10 數(shù)據(jù)處理與分析32-34
• 第4章 結(jié)果與分析34-51
• 4.1 成功構(gòu)建表達(dá)Rv2788基因的重組恥垢分枝桿菌34-36
• 4.1.1 體外擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌Rv2788基因34
• 4.1.2 成功構(gòu)建重組恥垢分枝桿菌Ms_Rv278834-35
• 4.1.3 Rv2788重組蛋白在恥垢分枝桿菌中成功表達(dá)35-36
• 4.2 Rv2788重組蛋白在大腸桿菌BL21中的表達(dá)與純化36
• 4.3 Rv2788重組蛋白不影響恥垢分枝桿菌的生長速率36-37
• 4.4 Rv2788過表達(dá)改變重組恥垢分枝桿菌的菌落形態(tài)37-38
• 4.5 Rv2788過表達(dá)對重組恥垢分枝桿菌的滑動能力無明顯影響38-39
• 4.6 Rv2788過表達(dá)改變重組恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁的脂肪酸組分39
• 4.7 Rv2788增強(qiáng)重組恥垢分枝桿菌的抗壓能力39-43
• 4.7.1 Rv2788過表達(dá)增強(qiáng)重組恥垢分枝桿菌對過氧化氫（H_2O_2）的耐受40
• 4.7.2 Rv2788過表達(dá)增強(qiáng)重組恥垢分枝桿菌對聯(lián)氨的耐受40-41
• 4.7.3 Rv2788過表達(dá)增強(qiáng)重組恥垢分枝桿菌對表面活性物質(zhì)SDS的耐受41-42
• 4.7.4 Rv2788過表達(dá)增強(qiáng)重組恥垢分枝桿菌對酸性壓力的耐受42-43
• 4.7.5 Rv2788過表達(dá)不影響恥垢分枝桿菌在營養(yǎng)饑餓條件下的存活43
• 4.8 Rv2788增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對抗生素的耐受能力43-45
• 4.9 Rv2788改變恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁的通透性45
• 4.10 Rv2788增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對卷曲霉素的敏感性45-46
• 4.11 Rv2788下調(diào)卷曲霉素相關(guān)基因的的轉(zhuǎn)錄水平46-48
• 4.12 Rv2788蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析48-51
• 4.12.1 Rv2788蛋白負(fù)調(diào)控可能的靶基因48-50
• 4.12.2 Rv2788蛋白正調(diào)控lexA基因的表達(dá)50-51
• 第5章 結(jié)果與討論51-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 致謝62-64
• 碩士期間發(fā)表和撰寫的文章64

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐苗,陳保文,沈小兵,蘇城,羅永艾,王國治;恥垢分枝桿菌作為免疫調(diào)節(jié)劑的研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2005年09期

2 湛W歐

本文編號：251205