本文關(guān)鍵詞：盲腸造疝原位接種瘤塊建立小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型方法的改進及評價，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本課題目的在于改良小鼠盲腸造疝原位接種瘤塊模型以提高肝轉(zhuǎn)移率,通過構(gòu)建該模型初步驗證“大腸癌隱性肝轉(zhuǎn)移”的假說,為進一步探索大腸癌肝轉(zhuǎn)移的機制提供基礎。本課題首先通過Transwell小室從普通CT26大腸癌細胞中篩選出具有高遷移力的細胞,并通過傳代培養(yǎng),擴增高遷移力的大腸癌細胞,將其用于構(gòu)建小鼠盲腸造疝原位接種瘤塊模型,以提高該模型的肝轉(zhuǎn)移率;接著通過將普通型、低遷移力型、高遷移力型CT26細胞用于構(gòu)建模型,比較各組模型中的肝轉(zhuǎn)移率以驗證高遷移力型CT26大腸癌細胞是否能夠提高模型的肝轉(zhuǎn)移率,通過免疫組化方法驗證其準確性,并擴大實驗樣本量驗證模型的穩(wěn)定性;觀測小鼠盲腸造疝原位接種瘤塊模型的生長特點,篩選出大腸癌隱性肝轉(zhuǎn)移模型,通過病理學確認,應用雙向差異凝膠電泳方法對比其與顯性肝轉(zhuǎn)移和正常對照組間的差異蛋白質(zhì),初步驗證“大腸癌隱性肝轉(zhuǎn)移”的理論。方法:實驗一:高遷移力CT26大腸癌細胞的培養(yǎng)與篩選選取CT26大腸癌細胞,在含10%小牛血清DMEM完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng),待細胞數(shù)足夠時,進行消化取出,在離心管中調(diào)整濃度,將一定量細胞加入至普通6孔板中,同時加入適量DMEM完全培養(yǎng)液(這類細胞標記為A組);將等量數(shù)目細胞移入Transwell上室中并加入適量高糖DMEM培養(yǎng)液,下室中加入適量DMEM完全培養(yǎng)液(標記為B組);每12小時動態(tài)觀察Transwell上室及下室細胞生長情況及細胞形態(tài),并與A組細胞相對比,約72小時后將上室中細胞通過消化移出至普通培養(yǎng)皿中(標記為B上組)進行正常培養(yǎng),下室中細胞繼續(xù)正常培養(yǎng)(標記為B下組)。實驗二:改良模型的構(gòu)建及其穩(wěn)定性的驗證將A組、B上組、B下組CT26大腸癌細胞從培養(yǎng)皿中消化出來,用1×PBS重懸細胞,分別用注射器在3只SPF級,4-5周,雄性BABL/c小鼠的項背部進行接種,分別標號A、B上、B下,經(jīng)13天正常飲食后,每只小鼠項背部長出大小約1.5×1.5cm的瘤塊,取出項背部瘤塊剪碎成2mm大小的小瘤塊,標號為A組、B上組、B下組各6只同類小鼠,分別接種相應編號的小瘤塊,利用盲腸造疝原位接種瘤塊法建立大腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型。建模后小鼠正常飲食,動態(tài)觀察瘤塊生長情況、小鼠體重,于5周后統(tǒng)一處死,觀察肝臟大體標本情況,觀測表面是否有結(jié)節(jié),并將標本做成蠟塊,行薄層切片病理檢查,確定該結(jié)節(jié)是否為顯性肝轉(zhuǎn)移,將各組之間顯性肝轉(zhuǎn)移情況進行對比,驗證B下組CT26大腸癌細胞是否具有高遷移力;比較各組之間肝臟轉(zhuǎn)移瘤及原位瘤中S100A8、MMP2、Vimentin等蛋白的表達情況。利用B下組細胞重新對36只小鼠進行模型構(gòu)建,標記為C組,比較C組與B下組小鼠之間的肝轉(zhuǎn)移率,驗證改良模型的穩(wěn)定性。實驗三:大腸癌隱性肝轉(zhuǎn)移假說的驗證利用B下組CT26大腸癌細胞,根據(jù)實驗二步驟構(gòu)建改良盲腸造疝原位接種瘤塊法建立大腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型,于接種瘤塊后第5周統(tǒng)一處死小鼠,若其肝臟表面存在結(jié)節(jié)并在病理下確認是大腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤塊歸類為大腸癌顯性肝轉(zhuǎn)移(Colorectal dominant liver metastases,CD)組,肝臟表面無結(jié)節(jié)并在病理下出現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶歸類為大腸癌隱性肝轉(zhuǎn)移(Colorectal recessive liver metastases,CR)組,10只同類小鼠單純進行同樣手術(shù)操作而不接種瘤塊,歸類為非大腸癌(non-Colorectal,NC)組。在實驗三中CR組、CD組、NC組小鼠隨機抽取7個新鮮肝臟標本進行相應預處理后,行雙向差異凝膠電泳方法檢查,分離各組小鼠肝臟內(nèi)蛋白質(zhì),并統(tǒng)計分析差異蛋白,驗證大腸癌隱性肝轉(zhuǎn)移理論。結(jié)果:實驗一:高遷移力CT26大腸癌細胞的培養(yǎng)與篩選12小時后下室中沒有出現(xiàn)遷移細胞(B下組),24小時后出現(xiàn)的遷移細胞與A組細胞、B上組細胞對比發(fā)現(xiàn):前者細胞形態(tài)較圓,突觸較少、較短,呈星形的細胞相對較少。72小時后,遷移細胞數(shù)目增多,細胞貼壁生長后突觸延伸,與A組細胞相比,細胞突觸數(shù)目相對較少,但細胞突觸較A組細胞較長。實驗二:改良模型的構(gòu)建及其穩(wěn)定性的驗證建模后小鼠術(shù)后恢復良好,創(chuàng)口無出現(xiàn)感染、瘺道,B上組⑤小鼠不成瘤,整體成瘤率為94.4%,B下組小鼠體重較其余2組低,與B上組小鼠相比差異性較大(P0.05),B下組瘤塊體積顯著大于其余2組(P0.05)。5周后小鼠統(tǒng)一處死,A組、B上組小鼠肝臟大體標本無肝轉(zhuǎn)移灶,B下組小鼠中2只小鼠肝臟見可疑轉(zhuǎn)移灶,病理結(jié)果提示前2組小鼠肝臟只出現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶,B下組小鼠中2只小鼠肝臟轉(zhuǎn)移灶明確為大腸癌肝轉(zhuǎn)移;B下組小鼠原位瘤組織中S100A8蛋白表達水平顯著高于其余2組(P0.05),B下組小鼠肝轉(zhuǎn)移灶組織中S100A8蛋白表達水平高于原位瘤組織,但無統(tǒng)計學意義;B下組小鼠原位瘤組織中MMP-2蛋白表達水平高于其余2組(P0.05),而B下組顯著高于B上組(P0.05),小鼠肝轉(zhuǎn)移灶組織與原位瘤組織中MMP-2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義;B下組小鼠原位瘤組織中Vimentin蛋白表達水平顯著高于其余2組(P0.05),B下組小鼠肝轉(zhuǎn)移灶組織中Vimentin蛋白表達水平高于原位瘤組織(P0.05)。通過擴大模型的數(shù)量,肝轉(zhuǎn)移率為27.7%,與前期造模時肝轉(zhuǎn)移率比較無統(tǒng)計學差異(P0.05),提示改良模型存在較好的穩(wěn)定性。實驗三:大腸癌隱性肝轉(zhuǎn)移假說的驗證CD組中有7只小鼠肝臟大體標本可觀察轉(zhuǎn)移灶及病理下確認為大腸癌肝轉(zhuǎn)移,肝臟病理出現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶則納入CR組,肝轉(zhuǎn)移率為25%,接近于B下組小鼠的肝轉(zhuǎn)移率。通過雙向差異凝膠電泳電泳分離3組小鼠肝臟蛋白質(zhì),利用DecyderTM2D6.5軟件分析CD組與NC組存在的差異蛋白位點數(shù)平均為107個,CR組與NC組存在67個蛋白差異位點,CR組與CD組存在差異蛋白位點數(shù)平均為23個,初步論證“大腸癌隱性肝轉(zhuǎn)移”的理論假說。結(jié)論:1.通過Transwell小室從體外分離培養(yǎng),分離出具有較高的遷移力的CT26大腸癌細胞。2.利用具有較高遷移力的CT26大腸細胞進行盲腸造疝原位接種瘤塊模型構(gòu)建,提高模型的肝轉(zhuǎn)移率,并且具有較好的穩(wěn)定性。3.根據(jù)盲腸造疝原位接種大腸癌模型,模擬隱性肝轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,并通過病理學和蛋白質(zhì)組學方法,初步論證“大腸癌隱性肝轉(zhuǎn)移”理論的可行性。
【關(guān)鍵詞】：大腸癌肝轉(zhuǎn)移 CT26細胞 小鼠模型 Transwell 免疫組化 雙向蛋白凝膠電泳
【學位授予單位】：廣東藥學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34;R-332
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表3-7
• 摘要7-11
• Abstract11-16
• 前言16-20
• 主要材料與方法20-46
• 實驗一 高遷移力CT26 大腸癌細胞的培養(yǎng)與篩選20-27
• 1 試驗材料20-23
• 1.1 細胞系20
• 1.2 主要試劑20
• 1.3 試劑配制20-22
• 1.4 主要儀器22-23
• 2 實驗方法23-27
• 2.1 復蘇細胞23
• 2.2 細胞換液23-24
• 2.3 細胞傳代24
• 2.4 Transwell 遷移實驗24-25
• 2.5 細胞凍存25-27
• 實驗二 改良模型的構(gòu)建及其穩(wěn)定性的驗證27-34
• 1 試驗材料27-29
• 2 試驗方法29-34
• 2.1 細胞懸液制備29-30
• 2.2 大腸癌模型的建立30-31
• 2.3 實驗相關(guān)指標觀察、樣本采集、處理31-34
• 實驗三 大腸癌隱性肝轉(zhuǎn)移假說的驗證34-45
• 1 試驗材料34-37
• 2 試驗方法37-45
• 2.1 細胞懸液制備37
• 2.2 大腸癌模型的建立37
• 2.3 實驗相關(guān)指標觀察、樣本采集、處理37-45
• 附 技術(shù)線路圖45-46
• 結(jié)果46-68
• 實驗一46-49
• 細胞形態(tài)變化46-49
• 實驗二49-59
• 1 小鼠一般特征49-51
• 2 小鼠肝臟大體標本51-52
• 3 肝臟組織病理學變化52
• 4 各組大腸癌顯性肝轉(zhuǎn)移率比較52-53
• 5 S100A8、MMP-2、Vimentin等蛋白免疫組化檢測結(jié)果53-58
• 6 改良模型穩(wěn)定性的驗證58-59
• 實驗三59-68
• 1 小鼠一般特征59
• 2 小鼠肝臟大體標本59-60
• 3 肝臟組織病理學變化60-61
• 4 再次分組及各組小鼠體重、瘤塊體積的比較61-64
• 5 實驗三中CR組、CD組、NC組小鼠肝臟中差異蛋白比較64-68
• 討論68-74
• 附圖74-75
• 參考文獻75-81
• 致謝81-82
• 文獻綜述82-90
• 參考文獻88-90

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張凌志,邸菁,王運杰,趙昕,張朝東;Transwell小室篩選高侵襲性C6細胞MMP-2和TIMP-2的表達[J];腫瘤防治雜志;2005年10期

2 黃寶玉;趙任;秦婧;賈曉斌;朱建偉;;靶向干預N-W ASP功能區(qū)對大腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響[J];世界華人消化雜志;2009年21期

  本文關(guān)鍵詞：盲腸造疝原位接種瘤塊建立小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型方法的改進及評價，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：251185