【摘要】：【目的】研究低氧對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增殖的影響，以及在低氧情況下PASMCs中的SUMO-1、HIF-1α及其下游靶基因VEGF的表達(dá)變化規(guī)律及相互關(guān)系；探討SUMO-1對(duì)HIF-1α和VEGF基因表達(dá)的影響以及它們?cè)诘脱跛碌腜ASMCs增殖中的作用，進(jìn)而參與低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）的發(fā)生發(fā)展，為HPH發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。 【方法】實(shí)驗(yàn)共分三個(gè)部分。(1)分離大鼠PASMCs并低氧處理：組織貼壁法分離并原代培養(yǎng)雄性SD大鼠PASMCs，光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，并通過透視電鏡以及α-SM-actin的免疫細(xì)胞學(xué)法進(jìn)行鑒定。將2-3代對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞置于37℃，含有1%O2、5%CO2、94%N2的三氣培養(yǎng)箱中，處理不同的時(shí)間復(fù)制體外大鼠HPH分子模型。(2)檢測(cè)低氧對(duì)大鼠PASMCs的影響：將細(xì)胞分別在常氧和（或）低氧情況下處理2h、6h、12h、24h、48h，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)低氧對(duì)細(xì)胞增殖的影響。同樣方法將細(xì)胞分為常氧對(duì)照組和缺氧2h、6h、12h、24h組，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法和Western blo（tWB）法分別檢測(cè)PASMCs中SUMO-1、HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)水平。免疫細(xì)胞熒光法分別檢測(cè)常氧及低氧情況下SUMO-1和HIF-1α在PASMCs中的表達(dá)情況。(3)用攜帶SUMO-1基因的慢病毒干預(yù)大鼠PASMCs，檢測(cè)低氧對(duì)PASMCs的影響：構(gòu)建攜帶有siRNA和真核表達(dá)SMUO-1的慢病毒，感染至PASMCs中，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、空載病毒組、沉默SUMO-1組（SUMO-1-RNAi-LV）和真核表達(dá)SUMO-1組（SUMO-1-LV），將上述幾組分別在低氧情況下處理0h、2h、6h、12h、24h、48h，Brdu滲入法檢測(cè)低氧對(duì)各組PASMCs的增殖的影響。再將上述各組分別常氧和缺氧處理12h，RT-PCR和WB法分別檢測(cè)SUMO-1、HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)情況。 【結(jié)果】 1.分離大鼠PASMCs并鑒定： （1）組織塊貼壁法成功分離出雄性大鼠PASMCs。用含1%青霉素-鏈霉素、15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基原代培養(yǎng)，3-5d后有少量細(xì)胞從組織塊周圍游離出來，7-10d后細(xì)胞融合成片，呈典型“峰-谷”狀分布，消化傳代至第3代； （2）倒置相差顯微鏡下，PASMCs呈長梭形放射狀生長，細(xì)胞中心有卵圓形細(xì)胞核。細(xì)胞鋪滿瓶壁時(shí)，形成“峰—谷”狀表現(xiàn)。 （3）α-SM-actin的免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，細(xì)胞質(zhì)中有較多與細(xì)胞縱軸相平行的絲狀物被染成棕黃色，陽性率達(dá)到96%以上；免疫細(xì)胞熒光顯示，胞漿中有較強(qiáng)的紅色熒光，呈與細(xì)胞縱軸平行的絲狀排列，而細(xì)胞核未著色；均表明為大鼠PASMCs。 （4）透視電鏡下，可見細(xì)胞及胞核均呈長梭形，異染色質(zhì)多；胞漿內(nèi)有許多與細(xì)胞縱軸平行的肌絲，大量胞飲，肌膜下有少量密斑和密體，缺乏高爾基體。 2．低氧對(duì)大鼠PASMCs的影響： （1）MTT比色法結(jié)果：常氧和低氧情況下，隨著時(shí)間的遞增，大鼠PASMCs的吸光度（A值）亦逐漸增加，且各時(shí)間點(diǎn)缺氧組A值均高于相對(duì)應(yīng)的常氧組。比較缺氧組之間的差異顯示：A值在缺氧12h組開始明顯增高（p＜0.05），缺氧24h組達(dá)到高峰值（p＜0.05），而缺氧48h組進(jìn)入平臺(tái)期。 （2）PCNA的免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果：隨著缺氧時(shí)間的遞增，PASMCs中的陽性細(xì)胞逐漸增多。且陽性細(xì)胞比率在缺氧12h組開始明顯增高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），缺氧24h組達(dá)到高峰值（p＜0.05），而缺氧48h組進(jìn)入平臺(tái)期。 （3）大鼠PASMCs中的SUMO-1、VEGF mRNA在缺氧2h組表達(dá)明顯增多（p＜0.05），缺氧12h組達(dá)高峰（p＜0.05），缺氧24h組趨于平臺(tái)期；HIF-1α mRNA表達(dá)隨著缺氧時(shí)間的遞增而增加，但與對(duì)照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。 （4）大鼠PASMCs中的SUMO-1、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)均隨著缺氧時(shí)間的遞增而增加，且在缺氧12h組達(dá)到高峰值（p＜0.05），缺氧24h組趨于平臺(tái)期。 （5）常氧和低氧時(shí)SUMO-1均表達(dá)于大鼠PASMCs的細(xì)胞核中；而HIF-1α在常氧情況下少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，低氧時(shí)明顯表達(dá)于細(xì)胞核中。 3. SUMO-1基因干預(yù)后，低氧對(duì)大鼠PASMCs的影響： （1）Brdu滲入法結(jié)果顯示：隨著缺氧時(shí)間的遞增，各組大鼠PASMCs中的陽性細(xì)胞比率均逐漸增高。SUMO-1-RNAi-LV組的陽性細(xì)胞比率均低于相應(yīng)各組，缺氧12h、24h、48h時(shí)，其陽性率和相應(yīng)各組之間的差異有均統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；而SUMO-1-LV組的陽性細(xì)胞比率均高于相應(yīng)各組，缺氧6h、12h、24h、48h時(shí)，其陽性率和相應(yīng)各組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。 （2）大鼠PASMCs中的HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白，在SUMO-1-RNAi-LV組均明顯低于相應(yīng)對(duì)照組（均P＜0.05）、在SUMO-1-LV組均明顯高于相應(yīng)對(duì)照組（均P＜0.05），而且這種差異在低氧情況下更顯著（P＜0.05）。 【結(jié)論】 1.低氧可明顯促進(jìn)體外原代培養(yǎng)的大鼠PASMCs的增殖。 2.低氧情況下，HIF-1α由大鼠PASMCs的細(xì)胞質(zhì)移至細(xì)胞核內(nèi)，而細(xì)胞核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的SUMO-1可能參與改變HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性與穩(wěn)定性。 3.低氧誘導(dǎo)大鼠PASMCs中的SUMO-1介導(dǎo)HIF-1α發(fā)生SUMO化，上調(diào)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性及穩(wěn)定性，導(dǎo)致HIF-1α下游靶基因VEGF等轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而參與大鼠PASMCs的低氧性增殖。
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【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2498446