【摘要】：【目的】研究低氧對體外培養(yǎng)的大鼠肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）增殖的影響，以及在低氧情況下PASMCs中的SUMO-1、HIF-1α及其下游靶基因VEGF的表達變化規(guī)律及相互關系；探討SUMO-1對HIF-1α和VEGF基因表達的影響以及它們在低氧所致的PASMCs增殖中的作用，進而參與低氧性肺動脈高壓（HPH）的發(fā)生發(fā)展，為HPH發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。 【方法】實驗共分三個部分。(1)分離大鼠PASMCs并低氧處理：組織貼壁法分離并原代培養(yǎng)雄性SD大鼠PASMCs，光鏡下觀察細胞的形態(tài)，并通過透視電鏡以及α-SM-actin的免疫細胞學法進行鑒定。將2-3代對數(shù)生長期的細胞置于37℃，含有1%O2、5%CO2、94%N2的三氣培養(yǎng)箱中，處理不同的時間復制體外大鼠HPH分子模型。(2)檢測低氧對大鼠PASMCs的影響：將細胞分別在常氧和（或）低氧情況下處理2h、6h、12h、24h、48h，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法和增殖細胞核抗原（PCNA）的免疫細胞化學法檢測低氧對細胞增殖的影響。同樣方法將細胞分為常氧對照組和缺氧2h、6h、12h、24h組，逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法和Western blo（tWB）法分別檢測PASMCs中SUMO-1、HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白的表達水平。免疫細胞熒光法分別檢測常氧及低氧情況下SUMO-1和HIF-1α在PASMCs中的表達情況。(3)用攜帶SUMO-1基因的慢病毒干預大鼠PASMCs，檢測低氧對PASMCs的影響：構建攜帶有siRNA和真核表達SMUO-1的慢病毒，感染至PASMCs中，將細胞隨機分為空白對照組、空載病毒組、沉默SUMO-1組（SUMO-1-RNAi-LV）和真核表達SUMO-1組（SUMO-1-LV），將上述幾組分別在低氧情況下處理0h、2h、6h、12h、24h、48h，Brdu滲入法檢測低氧對各組PASMCs的增殖的影響。再將上述各組分別常氧和缺氧處理12h，RT-PCR和WB法分別檢測SUMO-1、HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白表達情況。 【結果】 1.分離大鼠PASMCs并鑒定： （1）組織塊貼壁法成功分離出雄性大鼠PASMCs。用含1%青霉素-鏈霉素、15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基原代培養(yǎng)，3-5d后有少量細胞從組織塊周圍游離出來，7-10d后細胞融合成片，呈典型“峰-谷”狀分布，消化傳代至第3代； （2）倒置相差顯微鏡下，PASMCs呈長梭形放射狀生長，細胞中心有卵圓形細胞核。細胞鋪滿瓶壁時，形成“峰—谷”狀表現(xiàn)。 （3）α-SM-actin的免疫細胞化學顯示，細胞質中有較多與細胞縱軸相平行的絲狀物被染成棕黃色，陽性率達到96%以上；免疫細胞熒光顯示，胞漿中有較強的紅色熒光，呈與細胞縱軸平行的絲狀排列，而細胞核未著色；均表明為大鼠PASMCs。 （4）透視電鏡下，可見細胞及胞核均呈長梭形，異染色質多；胞漿內(nèi)有許多與細胞縱軸平行的肌絲，大量胞飲，肌膜下有少量密斑和密體，缺乏高爾基體。 2．低氧對大鼠PASMCs的影響： （1）MTT比色法結果：常氧和低氧情況下，隨著時間的遞增，大鼠PASMCs的吸光度（A值）亦逐漸增加，且各時間點缺氧組A值均高于相對應的常氧組。比較缺氧組之間的差異顯示：A值在缺氧12h組開始明顯增高（p＜0.05），缺氧24h組達到高峰值（p＜0.05），而缺氧48h組進入平臺期。 （2）PCNA的免疫細胞化學法結果：隨著缺氧時間的遞增，PASMCs中的陽性細胞逐漸增多。且陽性細胞比率在缺氧12h組開始明顯增高，與對照組比較有統(tǒng)計學意義（p＜0.05），缺氧24h組達到高峰值（p＜0.05），而缺氧48h組進入平臺期。 （3）大鼠PASMCs中的SUMO-1、VEGF mRNA在缺氧2h組表達明顯增多（p＜0.05），缺氧12h組達高峰（p＜0.05），缺氧24h組趨于平臺期；HIF-1α mRNA表達隨著缺氧時間的遞增而增加，但與對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。 （4）大鼠PASMCs中的SUMO-1、HIF-1α、VEGF蛋白表達均隨著缺氧時間的遞增而增加，且在缺氧12h組達到高峰值（p＜0.05），缺氧24h組趨于平臺期。 （5）常氧和低氧時SUMO-1均表達于大鼠PASMCs的細胞核中；而HIF-1α在常氧情況下少量表達于細胞質中，低氧時明顯表達于細胞核中。 3. SUMO-1基因干預后，低氧對大鼠PASMCs的影響： （1）Brdu滲入法結果顯示：隨著缺氧時間的遞增，各組大鼠PASMCs中的陽性細胞比率均逐漸增高。SUMO-1-RNAi-LV組的陽性細胞比率均低于相應各組，缺氧12h、24h、48h時，其陽性率和相應各組之間的差異有均統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；而SUMO-1-LV組的陽性細胞比率均高于相應各組，缺氧6h、12h、24h、48h時，其陽性率和相應各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。 （2）大鼠PASMCs中的HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白，在SUMO-1-RNAi-LV組均明顯低于相應對照組（均P＜0.05）、在SUMO-1-LV組均明顯高于相應對照組（均P＜0.05），而且這種差異在低氧情況下更顯著（P＜0.05）。 【結論】 1.低氧可明顯促進體外原代培養(yǎng)的大鼠PASMCs的增殖。 2.低氧情況下，HIF-1α由大鼠PASMCs的細胞質移至細胞核內(nèi)，而細胞核內(nèi)穩(wěn)定表達的SUMO-1可能參與改變HIF-1α的轉錄活性與穩(wěn)定性。 3.低氧誘導大鼠PASMCs中的SUMO-1介導HIF-1α發(fā)生SUMO化，上調HIF-1α的轉錄活性及穩(wěn)定性，導致HIF-1α下游靶基因VEGF等轉錄激活，進而參與大鼠PASMCs的低氧性增殖。
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【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2498446