【摘要】：隨著人類生活水平和生存環(huán)境的改變,代謝與內(nèi)分泌疾病的發(fā)病率逐年上升。糖尿病是其中最常見的一種慢性疾病,其主要特征是血糖代謝的紊亂,分為Ⅰ型及Ⅱ型糖尿病,臨床上95%以上患者為Ⅱ型糖尿病(T2DM)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型糖尿病發(fā)病的主要原因是胰島素抵抗,其貫穿于Ⅱ型糖尿病的整個(gè)過程。雖然多項(xiàng)研究結(jié)果提示胰島素抵抗與激素因子、炎癥反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等共同作用有關(guān),但關(guān)于胰島素抵抗的具體機(jī)制尚不明確。MicroRNAs (miRNAs)是一大類進(jìn)化保守的小分子非編碼RNAs,典型的miRNAs由20-25個(gè)單核苷酸組成,miRNAs可通過序列特異性的方式與特定靶基因的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)相互作用來調(diào)節(jié)靶基因的蛋白表達(dá),從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。許多miRNA與Ⅱ型糖尿病的發(fā)展有著密切的關(guān)系。Zampetaki等監(jiān)測到,健康人且后來發(fā)生糖尿病的那些患者其血漿中有多種miRNAs的水平逐漸發(fā)生變化,如microRNA-126(miR-126)在糖尿病人血漿中的含量明顯減少。因此,我們認(rèn)為miR-126與Ⅱ型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展可能有密切關(guān)系。鑒于目前miR-126與Ⅱ型糖尿病發(fā)病機(jī)制尚不明確,本課題在INS-1細(xì)胞(大鼠胰島β細(xì)胞株)應(yīng)用miRNA的過/低表達(dá)及功能研究等方法,探討了miR-126對胰島素信號通路的調(diào)控作用及機(jī)制。 目的 本課題旨在研究miR-126對INS-1細(xì)胞胰島素信號通路的調(diào)控作用及機(jī)制,為Ⅱ型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展提供新的理論基礎(chǔ)及潛在的治療靶點(diǎn)。 方法 生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-126的潛在靶基因。以培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞為模型,將人工合成的miR-126模擬物進(jìn)行轉(zhuǎn)染,并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法及熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的INS-1細(xì)胞用人工合成胰島素(100nM)刺激12小時(shí),提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行BCA蛋白定量。利用Western Blot方法檢測miR-126對預(yù)測靶基因蛋白表達(dá)的影響;利用MTT法檢測miR-126對INS-1細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果 通過生物信息學(xué)檢索PicTar、BibiServ等軟件發(fā)現(xiàn):在胰島素受體底物-1(IRS-1)及PIK3R2 mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)存在miR-126的潛在結(jié)合位點(diǎn),二者與miR-126結(jié)合自由能分別為?19.3和?19.4 kcal/mol,提示miR-126可能調(diào)控IRS-1及PIK3R2 mRNA的表達(dá)。為了干預(yù)內(nèi)源性miRNA的表達(dá),我們將人工合成miR-126模擬物轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞48小時(shí),定量PCR結(jié)果顯示:人工合成的miRNA模擬物在體外可有效調(diào)節(jié)內(nèi)源性miRNA的表達(dá)。為進(jìn)一步證明IRS-1和PIK3R2是miR-126的靶點(diǎn),我們將INS-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-126 mimics、miR-126 mutation、miRNA control mimics或Si-IRS1 48小時(shí)后用100nM胰島素刺激12小時(shí),Western blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-126 mimics以及Si-IRS1組IRS-1、PIK3R2及Akt蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。另外,我們用100nM胰島素不同時(shí)間段(0分鐘、1分鐘、5分鐘、10分鐘、30分鐘、60分鐘)刺激INS-1細(xì)胞,用Western blot方法檢測Akt蛋白磷酸化水平,結(jié)果顯示:胰島素可時(shí)間依賴性促進(jìn)INS-1細(xì)胞Akt磷酸化效應(yīng),而Akt蛋白表達(dá)無明顯變化。另外,為進(jìn)一步探討miR-126與INS-1細(xì)胞功能的關(guān)系,我們將INS-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-126 mimics、miRNA control mimics(CTm)或Si-IRS1 48小時(shí)后用100nM胰島素刺激12小時(shí),利用MTT法檢測INS-1細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果顯示:與對照組相比,過表達(dá)miR-126組INS-1細(xì)胞的增殖明顯受到抑制,其抑制率達(dá)30.05%。 結(jié)論 IRS-1和PIK3R2 mRNA是miR-126的靶點(diǎn),miR-126通過作用于IRS-1及PIK3R2基因3’端非編碼區(qū)上特異性靶序列抑制INS-1細(xì)胞IRS-1、PIK3R2及下游Akt蛋白的表達(dá);胰島素可時(shí)間依賴性促進(jìn)INS-1細(xì)胞Akt磷酸化效應(yīng);miR-126可能以IRS-1及PIK3R2為靶點(diǎn)抑制IRS-1/PI3K/Akt信號通路,從而抑制INS-1細(xì)胞的增殖。 炎癥反應(yīng)貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段。其初期特征是白細(xì)胞的聚集和內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的激活。MicroRNAs(miRNAs)是一大類進(jìn)化保守的小分子非編碼RNAs,典型的miRNA由20-25個(gè)單核苷酸組成,miRNAs可通過序列特異性的方式與特定靶基因的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)相互作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá),然而miRNAs與內(nèi)皮功能的關(guān)聯(lián)尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-155和miR-221/222在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)以及血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)高度表達(dá)。Ets-1是與炎癥及血管腔形成聯(lián)系密切的一種重要轉(zhuǎn)錄因子,通過生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn):ETS-1 mRNA的3’非翻譯區(qū)存在miR-155和miR-221/222的潛在結(jié)合位點(diǎn);Western blot實(shí)驗(yàn)也證明:在HUVECs中miR-155和miR-221以ETS-1為靶點(diǎn)發(fā)揮對靶基因的調(diào)控作用;另外,血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)也是miR-155的靶點(diǎn)。定量PCR結(jié)果顯示:HUVECs中血管緊張素Ⅱ(AngII)刺激Ets-1及其下游基因(包括VCAM1, MCP1 and FLT1)表達(dá)上調(diào),這種作用可部分被miR-155及miR-221/222的過表達(dá)逆轉(zhuǎn);miR-155以AT1R為靶點(diǎn),可減少AngII引起的HUVECs細(xì)胞遷移�？傊�,我們的研究發(fā)現(xiàn)HUVECs高表達(dá)的miR-155可能以AT1R及Ets-1為共同靶點(diǎn),而miR-221/222則以Ets-1為靶點(diǎn),它們對內(nèi)皮細(xì)胞多種炎癥分子的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用,并且可調(diào)節(jié)HUVECs的遷移。這些結(jié)果為動(dòng)脈粥樣硬化提供了新的理論依據(jù)及潛在治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:With the change of human living standard and living environment, the incidence of metabolic and endocrine diseases is increasing year by year. Diabetes is one of the most common chronic diseases, which is mainly characterized by the disorder of blood glucose metabolism, which is divided into type I and type II diabetes, and more than 95% of the patients are type II diabetes mellitus (T2DM). In recent years, it has been found that the main cause of type 鈪，

本文編號：2498262