【摘要】：研究背景 近年來,以干細(xì)胞為代表的再生醫(yī)學(xué)為多種終末期疾病的臨床再生治療帶來了新的希望。在心血管病、神經(jīng)損傷修復(fù)、肝臟衰竭等多種危害人類健康的重大疾病的治療領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景。其中自體骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)由于取材方便、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、無免疫原性、不涉及倫理道德、基因轉(zhuǎn)染效率高等特點(diǎn)受到更多的關(guān)注,并獲得可喜成績。然而,作為“細(xì)胞藥物”的干細(xì)胞在單獨(dú)移植到體內(nèi)受損部位后,均會不同程度地發(fā)生急性死亡和偏離目標(biāo)區(qū)域,極大影響B(tài)MSCs潛在的治療效果。 多種生物調(diào)節(jié)因子可以通過協(xié)調(diào)和引導(dǎo)各類細(xì)胞信號,促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和定向分化,其中主要包括堿性成纖維生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、血管生長因子(VEGF)等；此外,以基質(zhì)膠(Matrigel)構(gòu)建的三維骨架為載體,利用組織工程學(xué)方法進(jìn)一步改善細(xì)胞生長的微環(huán)境,據(jù)報道可有利于移植細(xì)胞的存活和分化。但是,各種生長因子與基質(zhì)膠的聯(lián)合應(yīng)用是否對BMSCs產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),目前仍然缺乏直接有力的研究依據(jù)。 干細(xì)胞在體存活的示蹤技術(shù)中,生物發(fā)光成像技術(shù)具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性,它主要利用熒光素酶和底物結(jié)合的高特異性,將活細(xì)胞獨(dú)有的化學(xué)能轉(zhuǎn)變成為可見光能,通過光子強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目的正比關(guān)系,監(jiān)測干細(xì)胞體內(nèi)外的增殖和存活情況。具有其他技術(shù)不可比擬的高靈敏度、高時間分辨率。 研究目的 1.通過觀察不同生長因子(VEGF、bFGF、IGF-1)對BMSCs增殖和凋亡的影響,闡明生長因子及Akt信號通路對BMSCs增殖和凋亡的作用； 2.通過報告基因成像技術(shù)活體動態(tài)長程觀察不同生長因子(VEGF、bFGF、IGF-1)聯(lián)合基質(zhì)膠對BMSCs移植后體內(nèi)存活增殖的作用,并初步探討其機(jī)制。 實驗方法 第一部分：BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及生長因子對其在體外的增殖影響 1.分離培養(yǎng)B-actin-luc FVB轉(zhuǎn)基因小鼠來源的BMSCs,并采用貼壁篩選法進(jìn)一步純化,通過細(xì)胞表面標(biāo)志物(APC-CD90(+)、PE-CD44(+)、PE-CD34(-)和PE-CD45(-))進(jìn)行細(xì)胞流式分析鑒定； 2.培養(yǎng)至第3代的BMSCs,分別加入VEGF、bFGF、IGF-1 (20ng/ml,72h);利用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色實驗檢測各組BMSCs的增殖能力；TUNEL法染色實驗檢測各組BMSCs的體外凋亡情況；Western -blot方法檢測各組BMSCs中Akt及pAkt蛋白表達(dá)水平。 第二部分：生長因子聯(lián)合Matrigel對BMSCs在體的增殖影響 1. BMSCs分離培養(yǎng)鑒定方法同第一部分； 2.利用IVIS小動物活體成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞數(shù)量與光學(xué)信號強(qiáng)度的關(guān)系,確定移植細(xì)胞數(shù)量 3.將既定移植細(xì)胞數(shù)量與20μl基質(zhì)膠、20nng生長因子混合后,種植在B-Actin-luc FVB轉(zhuǎn)基因小鼠的近交系小鼠背部皮下；利用小動物活體成像系統(tǒng)觀察移植后既定時間點(diǎn)各組信號表達(dá)情況； 4.取第3周細(xì)胞移植組織標(biāo)本,TUNEL法檢測移植組織細(xì)胞凋亡情況；Western-blot方法檢測移植組織Akt及p-Akt蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 第一部分：BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及生長因子對其在體外的增殖影響 1.通過細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定確定所培養(yǎng)細(xì)胞為BMSCs; 2.MTT結(jié)果顯示,與對照組相比,bFGF(0.1051±0.01512%vs0.0671±0.01745%,P0.05)：IGF-1(0.10436±0.01252%vs0.0671±0.01745%,P0.05)均可明顯促進(jìn)BMSCs增殖； 3. TUNEL結(jié)果顯示,與對照組相比,bFGF(44.0±2.0%vs 56.0±3.7%,P0.05)、IGF-1(36.3±3.2% vs 56.0±3.7%,P0.05)可以抑制BMSCs凋亡； 4. Western-blot結(jié)果顯示,對照組相比,B+bFGF組(0.47±0.0306 vs 0.28±0.0378,p0.05)、B+IGF-1組(0.57±0.0200 vs 0.28±0.0378,p0.05)的pAkt蛋白表達(dá)水平明顯增高。 第二部分：生長因子聯(lián)合Matrigel對BMSCs在體的增殖影響 1.通過IVIS成像系統(tǒng)檢測,定量分析到Fluc的光學(xué)信號強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量呈線性相關(guān)； 2. IVIS成像結(jié)果顯示,移植后第5周(B+M+I)組細(xì)胞存活率明顯高于其他實驗組(B+M+I：21%,其他組均10%) (p0.05)； 3. TUNEL結(jié)果顯示,與對照組相比,B+M+b組(32.00±1.63%vs42.33±2.05%,P0.05),B+M+I組(26.66±1.69% vs 42.33±2.05%,P0.05)凋亡率明顯降低； 4. Western-blot結(jié)果顯示,與對照組相比,B+M+b組(0.49±0.032 vs0.33±0.0153,p0.05)和B+M+I組(0.63±0.025 vs 0.33±0.0153,p0.05),pAkt蛋白表達(dá)水平顯著增高。 結(jié)論 1.bFGF、IGF-1與VEGF相比,明顯促進(jìn)BMSCs增殖和抗凋亡； 2.在體分子影像研究進(jìn)一步證實IGF-1聯(lián)合Matrigel能夠明顯促進(jìn)移植BMSCs增殖,并抑制其凋亡； 3.IGF-1聯(lián)合Matrigel發(fā)揮協(xié)同作用可能與Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2489679