【摘要】：目的克隆小鼠BCL-2基因全長cDNA，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-bcl-2，并建立高表達(dá)BCL-2蛋白的PC12細(xì)胞，為研究BCL-2蛋白在酒精誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡中的作用提供依據(jù)。 方法從小鼠脾臟中提取總RNA，采用RT-PCR方法克隆BCL-2的cDNA，，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物并回收BCL-2基因。將全長BCL-2基因與pMD-19T載體連接，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、克隆、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及菌液DNA測序鑒定，檢測BCL-2基因的準(zhǔn)確性并檢測是否成功重組質(zhì)粒pMD19-T-bcl-2。用HindⅢ和EcoRⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒pcDNA3.1(-)和重組質(zhì)粒pMD19-T-bcl-2DNA進(jìn)行酶切，切割產(chǎn)物經(jīng)1%的DNA瓊脂糖凝膠電泳分離后，用T4DNA連接酶將所需片段連接，轉(zhuǎn)化、克隆、提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA，雙酶切鑒定確定真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-bcl-2是否構(gòu)建成功。采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，分別從PC12細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(-)的PC12細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了真核表達(dá)載體的PC12細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR的方法檢測細(xì)胞BCL-2基因mRNA的表達(dá)，應(yīng)用Western-blot的方法檢測BCL-2蛋白的表達(dá)。MTT法測定不同濃度酒精（100mmoL/L、200mmoL/L、400mmoL/L）對三種PC12細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果從小鼠脾臟獲得較純的RNA, RT-PCR方法獲得到BCL-2基因產(chǎn)物。BCL-2基因和pMD-19T載體連接后，經(jīng)PCR和菌液測序證實(shí)， BCL-2基因正確且已和pMD-19T載體成功連接，得到重組質(zhì)粒pMD19-T-bcl-2。雙酶切質(zhì)粒pMD19-T-bcl-2和pcDNA3.1(-) DNA并經(jīng)T4DNA連接酶連接所需片段后，構(gòu)建出真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-bcl-2。從3種不同的PC12細(xì)胞得到純度較高的RNA，經(jīng)RT-PCR和Western-blot分別檢測BCL-2mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示成功建立了高表達(dá)BCL-2蛋白的PC12細(xì)胞系。MTT結(jié)果表明，100mmol/L和200mmol/L酒精濃度時，BCL-2高表達(dá)的PC12細(xì)胞組的生存率顯著高于對照組（P0.01, P0.05），酒精濃度為400mmol/L時，兩組生存率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。BCL-2蛋白在酒精濃度為100~200mmol/L范圍內(nèi)，對酒精誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的損傷及凋亡的有保護(hù)作用。 結(jié)論1.利用pMD-19T Vector成功構(gòu)建出pcDNA3.1(-)-bcl-2真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后，表達(dá)高水平BCL-2mRNA和蛋白質(zhì)。 2.高表達(dá)BCL-2的PC12細(xì)胞能在一定濃度范圍內(nèi)抵抗酒精對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。
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【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 倪珍珍;徐翔;樓洪剛;;浙江省中小學(xué)生吸煙飲酒情況調(diào)查分析[J];中國藥物依賴性雜志;2010年03期

2 周濤,許百男,陳德蕙,闕海萍,林秋霞,呂雙紅,劉少君;PC12細(xì)胞分化的神經(jīng)元與離體培養(yǎng)的大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元之間功能性突觸的形成[J];中華神經(jīng)科雜志;2005年03期

本文編號：2488793