【摘要】：乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種在世界范圍內(nèi)嚴重危害人類健康的疾病。目前,全世界大約有3.5億人感染乙肝病毒,我國約有0.3億人患有乙型肝炎,有很大一部分患者并發(fā)肝硬化及原發(fā)性肝癌。我國是乙肝高流行區(qū),每年新發(fā)病例約200萬,造成的經(jīng)濟損失高達近萬億元。乙型肝炎病毒屬于嗜肝DNA病毒,僅感染靈長類動物及少數(shù)其它物種。經(jīng)過近半個世紀的研究,乙型肝炎至今仍然沒有被攻克,其原因主要是免疫耐受會造成HBV感染的慢性化,同時免疫耐受也是HBV持續(xù)感染的重要因素。因此,深入了解乙肝病毒免疫耐受的形成機制、弄清維持免疫耐受的分子基礎(chǔ)及其特征,這是目前攻克乙型病毒性肝炎的重要研究方向。研究乙肝病毒免疫耐受形成機制、弄清維持耐受的細胞學(xué)特征和分子機制需要打破動物模型造成的瓶頸。但迄今為止,可以用來研究乙型肝炎病毒的動物模型主要有黑猩猩、小鼠、土撥鼠、鴨等動物,它們由于自身局限性及穩(wěn)定性而不適合作為常規(guī)的實驗動物模型；更為重要的是：上述動物模型中乙型肝炎病毒DNA在建模初期就已穩(wěn)定的整合到動物肝細胞的基因組,形成了病毒與宿主細胞靜態(tài)相容的結(jié)果,因此不能反映病毒侵染過程中細胞內(nèi)動念變化的過程,更無法達到對免疫耐受形成前后的差異性研究。因此我們選用四環(huán)素調(diào)控的慢病毒系統(tǒng)來構(gòu)建乙肝動物模型并實現(xiàn)乙肝病毒基因在動物體內(nèi)的可調(diào)控表達,通過人為的控制來研究不同發(fā)育時期及不同免疫狀態(tài)下動物體內(nèi)的整體變化情況,以此來對形成免疫耐受前后的體內(nèi)狀態(tài)進行研究,預(yù)期找出免疫系統(tǒng)的差異性如特異性的分子或者靶點的差異,找到打破免疫耐受的突破口。這對于揭示乙肝病毒特異免疫耐受的形成機制、弄清維持耐受的細胞和分子基礎(chǔ)及特征,將會產(chǎn)生深遠的影響。在實驗室之前的工作中,已經(jīng)構(gòu)建了含有乙肝病毒各個基因(X,P,C,preC-C, S,preS2-S,PreS1-S2-S)的可誘導(dǎo)表達載體質(zhì)粒系統(tǒng),本研究中將載體利用慢病毒包裝細胞系HEK 293T細胞分別獲得含有調(diào)控質(zhì)粒pLVX-Tet-On和表達質(zhì)粒pLVX-X及pLVX-LS的病毒顆粒,獲得的病毒滴度達到可108LPs/mL。將包裝獲得的病毒等量混合后進行小鼠睪丸注射,每只雄性小鼠的左右側(cè)睪丸內(nèi)各注射約10μL的病毒,注射后與母鼠合籠,母鼠經(jīng)過懷孕、分娩生產(chǎn)獲得子代FO代小鼠。提取F0代小鼠的基因組,通過southern-blot和反向PCR的方法對子代小鼠基因組內(nèi)目的基因的整合情況進行研究分析。經(jīng)過鑒定后對其中含有四環(huán)素調(diào)控基因及乙肝病毒部分基因的小鼠進行誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達。誘導(dǎo)72h后提取其肝臟組織的蛋白質(zhì)進行western-blot驗證及其對其肝臟組織、腎臟組織進行免疫組織化學(xué)分析。檢測目的基因的蛋白表達情況。結(jié)果：本實驗共獲得F0代小鼠共96只,通過Southern-blot和反向PCR的方法對F0代小鼠基因組的分析,在所獲得的F0代小鼠中,四環(huán)素調(diào)控基因陽性小鼠共14只,陽性率為14.58%,乙肝病毒X組小鼠49只,陽性小鼠5只,陽性率為10.20%。將經(jīng)過鑒定后的小鼠進行誘導(dǎo),在小鼠飲水中加以濃度為1.5mg/mL的強力霉素(DOX)進行誘導(dǎo)乙肝病毒-X基因的蛋白表達,誘導(dǎo)72h后提取小鼠的肝臟組織及其肝臟組織內(nèi)總蛋白,進行western-blot分析及免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果表明：小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)其乙肝病毒-X基因的蛋白表達。經(jīng)過對小鼠的肝臟組織及腎臟組織的免疫組織化學(xué)分析,結(jié)果同樣表明小鼠體內(nèi)組織內(nèi)存在乙肝病毒的X蛋白。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62;R-332

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃芳;王毅剛;蔡榮;楊光華;錢程;;可誘導(dǎo)慢病毒載體的優(yōu)化策略及應(yīng)用[J];細胞生物學(xué)雜志;2007年06期

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本文編號：2470110