【摘要】：研究背景和目的: 骨是由細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和無機(jī)物組成的特殊結(jié)締組織,是人體承擔(dān)力學(xué)載荷的主要器官,并通過骨組織細(xì)胞進(jìn)行骨塑建和重建。骨重建不僅受到遺傳、激素、新陳代謝、年齡等生物學(xué)因素的影響,而且還依賴于其所處的力學(xué)環(huán)境。由Wolff定律可知,力學(xué)載荷缺失導(dǎo)致骨量減少,而適度的力學(xué)刺激能夠促進(jìn)骨形成。成骨細(xì)胞來源于間充質(zhì)干細(xì)胞,是骨生長(zhǎng)、重建和修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞。成骨細(xì)胞以及它的前體細(xì)胞對(duì)周圍生物力學(xué)環(huán)境的變化非常敏感,可以將感受到的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)樯飳W(xué)信號(hào)進(jìn)而調(diào)節(jié)骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。體內(nèi)骨組織所處的力學(xué)環(huán)境非常復(fù)雜,附著于骨基質(zhì)上的成骨細(xì)胞會(huì)受到多種生物學(xué)因素的干擾,因此,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)很難準(zhǔn)確反映力學(xué)刺激對(duì)成骨細(xì)胞的影響。對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞進(jìn)行離體力學(xué)加載實(shí)驗(yàn)可以有效排除體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中各種因素的干擾。此外,還可以設(shè)計(jì)力的加載方式、大小、頻率以及作用時(shí)間等力學(xué)參數(shù)準(zhǔn)確檢測(cè)力學(xué)刺激對(duì)成骨細(xì)胞的影響。成骨細(xì)胞是骨對(duì)力學(xué)信號(hào)進(jìn)行響應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞,但力學(xué)刺激對(duì)成骨細(xì)胞的影響以及成骨細(xì)胞的力學(xué)信號(hào)響應(yīng)機(jī)制仍不明確。本研究擬通過四點(diǎn)彎曲力學(xué)加載裝置對(duì)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行不同強(qiáng)度和不同時(shí)間的力學(xué)拉伸,研究力學(xué)信號(hào)對(duì)成骨細(xì)胞增殖、凋亡、分化和礦化的影響,并深入探討成骨細(xì)胞的力學(xué)信號(hào)響應(yīng)機(jī)制,為進(jìn)一步研究力學(xué)條件下骨發(fā)生、重建的生物學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。 研究方法: 1.應(yīng)用四點(diǎn)彎曲力學(xué)加載裝置對(duì)小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞施加頻率為0.5 HZ,不同強(qiáng)度(500με、1000με、2000με、3000με、5000με)的力學(xué)拉伸應(yīng)變,力學(xué)拉伸結(jié)束后采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況、DNA ladder和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況、RT-PCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)情況、Von Kossa染色檢測(cè)細(xì)胞礦化情況。 2.給MC3T3-E1細(xì)胞施加強(qiáng)度為2000με,頻率為0.5 HZ不同時(shí)間(2h、4h、8h、12h、24h)的力學(xué)拉伸應(yīng)變,拉伸結(jié)束后對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和礦化情況進(jìn)行檢測(cè)。 3.采用RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)力學(xué)拉伸應(yīng)變對(duì)BMPs/Smad信號(hào)通路中各個(gè)分子表達(dá)的影響;采用ELISA方法檢測(cè)力學(xué)拉伸后成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中BMP-2和BMP-4的含量;采用Western Blot方法檢測(cè)力學(xué)拉伸應(yīng)變對(duì)Smad蛋白的活化以及p-Smad向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的影響。 4.力學(xué)拉伸前2h以Noggin預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞,然后進(jìn)行8h的力學(xué)拉伸,檢測(cè)阻斷BMPs通路對(duì)力學(xué)拉伸過程中Smad蛋白的活化以及成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響;力學(xué)拉伸前轉(zhuǎn)染Smad4 siRNA抑制Smad4的表達(dá),然后進(jìn)行8h的力學(xué)拉伸,檢測(cè)力學(xué)拉伸后p-Smad的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移情況以及成 骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)情況。5.采用Western Blot方法檢測(cè)力學(xué)拉伸后p38MAPK和NF-κB通路的活化情況;力學(xué)拉伸前以PDTC預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞,檢測(cè)阻斷NF-κB通路對(duì)力學(xué)拉伸過程中BMPs表達(dá)的影響;力學(xué)拉伸前以Noggin預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞,檢測(cè)力學(xué)拉伸過程中p38MAPK的激活與BMPs信號(hào)的關(guān)系;力學(xué)拉伸前以SB203580預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞,檢測(cè)阻斷p38MAPK通路對(duì)力學(xué)拉伸過程中NF-κB通路的激活、BMPs的表達(dá)以及成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響。 6.采用RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)力學(xué)拉伸應(yīng)變對(duì)Smurf1、Smurf2和CKIP-1表達(dá)的影響。 7.力學(xué)拉伸前轉(zhuǎn)染Smurf1 siRNA,然后進(jìn)行8h的力學(xué)拉伸,檢測(cè)抑制Smurf1的表達(dá)對(duì)力學(xué)拉伸過程中Smad、p-Smad以及成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響;力學(xué)拉伸前以MG132預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞,檢測(cè)抑制蛋白酶體活性對(duì)力學(xué)拉伸過程中Smad和p-Smad的含量以及成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1. 1000με、2000με和3000με的力學(xué)拉伸強(qiáng)度能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá),其中2000με的作用最明顯,但各個(gè)力學(xué)拉伸強(qiáng)度均未影響成骨細(xì)胞的增殖、凋亡和礦化。 2. 2000με應(yīng)變強(qiáng)度下,不同時(shí)間的力學(xué)拉伸對(duì)成骨細(xì)胞增殖、凋亡和礦化沒有明顯作用。力學(xué)拉伸過程中成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)的上調(diào)有一定的時(shí)間依賴性:ALP的表達(dá)在力學(xué)拉伸4h時(shí)開始顯著升高,8h時(shí)表達(dá)最強(qiáng),24h后恢復(fù)正常水平;OCN的表達(dá)在力學(xué)拉伸8h時(shí)開始顯著升高,并持續(xù)高表達(dá)至24h;而Col I的表達(dá)在力學(xué)拉伸4h時(shí)開始顯著上調(diào),24h時(shí)表達(dá)水平仍高于對(duì)照組。 3.力學(xué)拉伸應(yīng)變能夠促進(jìn)BMP-2和BMP-4的表達(dá)和分泌。BMPRⅠ、Smad1和Smad5 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化,但它們的蛋白水平在力學(xué)拉伸后升高。Smad1和Smad5在力學(xué)拉伸過程中被激活,且激活的Smad(p-Smad)在細(xì)胞核內(nèi)的含量升高。 4. Noggin抑制了力學(xué)拉伸過程中Smad蛋白的活化,Smad4 siRNA抑制了力學(xué)拉伸過程中p-Smad向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。Noggin和Smad4 siRNA均能抑制力學(xué)拉伸過程中成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)。 5. p38MAPK通路在力學(xué)拉伸15min被激活,NF-κB通路在力學(xué)拉伸30min被激活,它們均在力學(xué)拉伸90min后失活;PDTC阻斷NF-κB通路抑制了力學(xué)拉伸過程中BMP-2和BMP-4的表達(dá);Noggin阻斷BMPs信號(hào)并未抑制力學(xué)拉伸過程中p38 MAPK通路的激活,表明力學(xué)拉伸過程中p38 MAPK的激活不依賴于BMPs信號(hào);SB203580阻斷p38 MAPK通路抑制了力學(xué)拉伸過程中NF-κB通路的活化、BMPs和成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá),表明力學(xué)拉伸過程中NF-κB通路的活化以及BMPs的表達(dá)依賴于p38MAPK通路。 6.力學(xué)拉伸應(yīng)變對(duì)Smurf2和CKIP-1的表達(dá)沒有明顯作用,但下調(diào)了Smurf1的表達(dá)。 7.轉(zhuǎn)染Smurf1 siRNA和MG132預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)一步上調(diào)了力學(xué)拉伸過程中BMPRⅠ和Smad蛋白的含量、Smad蛋白的激活以及成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。 結(jié)論: 1.力學(xué)拉伸應(yīng)變促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化。 2. BMPs/Smad信號(hào)通路在力學(xué)拉伸過程中被激活,力學(xué)信號(hào)通過BMPs/Smad通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)。 3. p38 MAPK通路和NF-κB通路在成骨細(xì)胞力學(xué)拉伸過程中存在偶聯(lián),力學(xué)信號(hào)通過p38 MAPK/NF-κB通路上調(diào)BMPs的表達(dá),并進(jìn)一步激活BMPs/Smad通路誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)。 4.力學(xué)拉伸下調(diào)了Smurf1的表達(dá)并進(jìn)一步抑制了Smurf1介導(dǎo)的BMPRⅠ和Smad蛋白的降解,Smurf1表達(dá)的下調(diào)促進(jìn)了力學(xué)拉伸過程中BMPs/Smad通路的活化。 綜上所述,力學(xué)信號(hào)通過激活p38MAPK/NF-κB通路和下調(diào)Smurf1的表達(dá)促進(jìn)BMPs/Smad通路在力學(xué)拉伸過程中的活化,并進(jìn)一步誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳東;吳建珊;閻福華;陳江;;高壓氧對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖和分化的影響[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2008年07期

2 張西正,康少華,蔡紹皙;一種四點(diǎn)彎曲單向交變應(yīng)變細(xì)胞加載裝置的研制[J];醫(yī)療衛(wèi)生裝備;1999年04期

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本文編號(hào)：2458461