【摘要】：神經(jīng)干/祖細(xì)胞(Neural Stem/Progenitor Cells， NSPCs)是中樞神經(jīng)中具有分裂潛能和自我更新能力的一類細(xì)胞，它可增殖及分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。近年的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)成年哺乳動物的腦組織仍有新生的神經(jīng)元不斷的產(chǎn)生，突破了以往認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞在出生前或者在出生后不久就是失去了再生能力相關(guān)理論。并且，通過近年的研究表明在成人的中樞系統(tǒng)中，例如側(cè)腦室壁、海馬齒狀回、室管膜下區(qū)、嗅球和脊髓等處存在神經(jīng)干細(xì)胞并且觀察到神經(jīng)細(xì)胞再生。同時研究證明了神經(jīng)干細(xì)胞的生理分化具有定向性，可以分化成神經(jīng)元以維持正常的神經(jīng)細(xì)胞代謝。雖然在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有神經(jīng)細(xì)胞的代謝，但是這種生理性的代償在腦缺血、急性脊髓損傷以及神經(jīng)系統(tǒng)退行性變等病理性損傷的修復(fù)中的能力不足。所以，NSPCs移植促進(jìn)功能恢復(fù)的研究成為焦點。 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)是已知體內(nèi)功能是通過提呈抗原活化靜息T細(xì)胞，抗原提呈是啟動、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。同時，DCs自身能分泌多種細(xì)胞因子參與機(jī)體內(nèi)環(huán)境的調(diào)控。Mikami等實驗證實：在體外DCs能促進(jìn)NSPCs的增殖，在局部移植DCs后，活化了內(nèi)源性NSPCs增殖促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長，從而促進(jìn)小鼠SCI后肢功能恢復(fù)。本課題組前期研究將DCs與NSPCs局部聯(lián)合移植對治療大鼠SCI時發(fā)現(xiàn)在局部損傷區(qū)域神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)生了變化,包括NGF(nerve growth factor)、 BDNF(brain-derived neural neurotrophic factor)、NT-3(neurotrophin-3)等的表達(dá)量。并且，Huaben等認(rèn)為DCs是抗原提呈的作用改變了內(nèi)環(huán)境，為脊髓損傷修復(fù)創(chuàng)造了條件。所以，內(nèi)環(huán)境的改變是否是與神經(jīng)營養(yǎng)因子有關(guān)，神經(jīng)營養(yǎng)因子是否與DCs與NSPCs的相互作用有關(guān)，尚待進(jìn)一步的探討。 我們假設(shè)DCs和NSPCs在體外共培養(yǎng)后促進(jìn)NSPCs增殖和分化的現(xiàn)象與共培養(yǎng)中神經(jīng)營養(yǎng)因子變化有關(guān)。我們實驗采用體外將兩種細(xì)胞共培養(yǎng)，在特異性酪氨酸激酶抑制劑K252a阻斷Trk家族受體和添加NT-3蛋白等實驗因素作用下觀察共培養(yǎng)各組NSPCs增殖情況和表面TrkC受體表達(dá)的變化，以及培養(yǎng)上清NT-3表達(dá)變化，初步探討DCs與NSPCs相互作用的機(jī)制。 研究目的： 本研究擬通過體外實驗觀察DCs與NSPCs的相互作用，并進(jìn)一步研究NT-3在DCs與NSPCs相互作用中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 1、構(gòu)建DCs和NSPCs的共培養(yǎng)體系，觀察DCs和NSPCs的相互作用，對作用后的NSPCs直徑和數(shù)量進(jìn)行測量。 2、檢測不同時間點和不同分組的上清中NT-3,BDNF,NGF的表達(dá)情況，主要是NT-3的表達(dá)量。 3、檢測共培養(yǎng)后NSPCs表面TrkC蛋白的表達(dá)情況。 材料與方法： 1.未成熟DCs的制備 參照Hauben[1]法制備未成熟DCs。 簡述如下，無菌操作，取SD大鼠(4-6周)雙下肢股骨和脛骨的骨髓細(xì)胞，消化吹打成單細(xì)胞懸液，加入IL-4、GM-CSF細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別在第2、4、6天半量或全量換液，培養(yǎng)第7天后細(xì)胞收集備用。 2.新生SD大鼠全腦神經(jīng)干細(xì)胞的制備 參照Mistry~([2])等培養(yǎng)方法并改良制備NSPCs的原代。簡述如下，NSPCs來源普通新生SD大鼠(1-3天)全腦分離，消化吹打成單細(xì)胞懸液，加入B27、b-FGF、EGF細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化，第3、6天換液，增殖培養(yǎng)７ｄ后收集細(xì)胞備用。 3．DCs與NSPCs Transwell共培養(yǎng) 培養(yǎng)方法：將培養(yǎng)第7天的NSPCs和DCs按1×10~5個/ml，2.5ml (下室)和1×10~6個/ml，1.5ml(上室，上下室接種密度比10:1)按NSPCs組、DCs/NSPCs+K252a組、DCs/NSPCs組和NSPCs+NT-3組接種于6孔培養(yǎng)板的Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中，膜孔徑為0.4μm上下室的培養(yǎng)液能相互通融。第3天換液1次，在倒置顯微鏡下觀察NSPCs形態(tài)變化，第7天拍攝神經(jīng)球圖片，用于神經(jīng)球直徑分析，收集神經(jīng)球備用。 4.免疫細(xì)胞熒光術(shù) 將Transwell共培養(yǎng)的NSPCs收集的懸浮細(xì)胞球、細(xì)胞爬片球分化用4%多聚甲醛固定，根據(jù)預(yù)實驗濃度加入一抗，4℃過夜，加入二抗在37℃孵育約2小時，Hochest染核。中性樹膠封片，激光共聚焦顯微鏡和普通熒光顯微鏡下檢測。 5．ELISA檢測Transwell共培養(yǎng)上清中NT-3的量 分別檢測DCs與NSPCsTranswell共培養(yǎng)上清0、12、24、36、48、60、72小時NT-3檢測和不同分組中對NT-3檢測。方法參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行(武漢博士德公司)。 6.Westrnblot檢測NSPCs表達(dá)TrkC的情況 將Transwell共培養(yǎng)各組的神經(jīng)球收集于離心管后，冰上裂解45min，取上清液，各組獲得的總蛋白加上樣緩沖液混合均勻，煮沸加熱5min。取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，在電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，封閉后加一抗４℃過夜，復(fù)溫，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗室溫孵育約1h，設(shè)β-actin為內(nèi)參照。 7．統(tǒng)計分析 本實驗內(nèi)容數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。樣本算術(shù)平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和概率值分別以(?)±s、p表示，行單因素方差分析。 結(jié)果： 1．在倒置顯微鏡下觀察各組NSPCs成球情況，發(fā)現(xiàn)NSPCs球直徑和數(shù)量在各組之間均存在著差異，DCs/NSPCs組和NSPCs＋NT-3組NSPCs球數(shù)量增多，且平均直徑與DCs/NSPCs+K252a組和NSPCs組的比較增大明顯(p＜0.05)。 2．共培養(yǎng)上清中NT-3、BDNF的表達(dá)上調(diào)，不同時間點(從0小時開始，每12小時收集一次)發(fā)現(xiàn)在48小時NT-3的表達(dá)量處于峰值。并且做組間比較DCs/NSPCs組的上清檢測出的NT-3含量較DCs組和NSPCs組差異明顯(p＜0.05)Cs/NSPCs組和DCs+NSPCs組間比較無明顯差異(p＞0.05)。 3．細(xì)胞免疫熒光染色法檢測Transwell共培養(yǎng)NSPCs細(xì)胞表面TrkC的表達(dá)情況，顯示：NSPCs組、DCs/NSPCs+K252a組、DCs/NSPCs組、NSPCs+NT-3組在共培養(yǎng)7天后NSPCs表面TrkC均陽性表達(dá)(CY3紅色熒光)，但是表達(dá)的量和熒光強(qiáng)度有差異性，DCs/NSPCs組和NSPCs+NT-3組明顯高于NSPCs組和DCs/NSPCs+K252a組(p＜0.05)。 4．Western Blot檢測顯示NSPCs細(xì)胞表面表達(dá)的TrkC的量按照NSPCs組、DCs/NSPCs+K252a組、DCs/NSPCs組、NSPCs+NT-3組強(qiáng)度漸增。TrkC的表達(dá)量(條帶灰度值)與內(nèi)參(β-actin)表達(dá)量比值之間的差異有顯著性(P 0.05)。說明在共培養(yǎng)體系中是隨著NT-3量的增加，其受體TrkC在NSPCs的表達(dá)也升高。 結(jié)論： 1．本實驗證明，體外DCs和NSPCs共同培養(yǎng)，DCs能夠促進(jìn)NSPCs球直徑的增加以及數(shù)量的增多。 2．DCs和NSPCs共同培養(yǎng)的上清中48小時NT-3的表達(dá)量是峰值，DCs+NSPCs組、DCs/NSPCs組48小時上清中NT-3的表達(dá)量比DCs組、NSPCs組多，差異顯著。 3．體外DCs和NSPCs共同培養(yǎng)，，免疫細(xì)胞熒光檢測顯示，在NSPCs球表面TrkC的表達(dá)量DCs+NSPCs組與DCs/NSPCs組明顯高于NSPCs組與DCs/NSPCs+K252a組的表達(dá)。 4．體外DCs和NSPCs共培養(yǎng)，Western Blot檢測顯示，NSPCs細(xì)胞表面TrkC的表達(dá)量在各組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異，DCs+NSPCs組和DCs/NSPCs組的灰度值明顯比NSPCs組與DCs/NSPCs+K252a組的高。 DCs+NSPCs組和DCs/NSPCs組的比較不明顯。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2458335