【摘要】：RUNX1(runt-related transcription factor 1)是造血發(fā)育中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一,在胚胎和成體造血過(guò)程都發(fā)揮重要作用。在成體造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)分化過(guò)程中RUNX1主要參與調(diào)控多個(gè)HSCs增殖、分化相關(guān)基因的表達(dá)。RUNX1的缺失抑制巨核細(xì)胞的成熟和T、B淋巴細(xì)胞的分化,其突變或基因重排與白血病的發(fā)生有關(guān)。在胚胎造血發(fā)育中,RUNX1參與調(diào)控血液血管干細(xì)胞(hemangioblast)向HSCs分化,敲除Runx1基因?qū)е屡咛ケ持鲃?dòng)脈-性腺-中腎(aorta-gonad-mesonephres region, AGM)區(qū)血管壁腹側(cè)無(wú)造血簇產(chǎn)生,而使永久造血(defenitive hematopoiesis)完全缺失。早期研究發(fā)現(xiàn),Runx1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在不同的發(fā)育階段存在可變剪接現(xiàn)象,剪接位點(diǎn)發(fā)生在外顯子5(Exon5)處,產(chǎn)生Ex5和ΔEx5兩種剪接體,ΔEx5剪接體因缺失外顯子5而使其表達(dá)產(chǎn)生的蛋白轉(zhuǎn)錄激活能力較低。同時(shí),其基因上游存在兩個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控Runx1的轉(zhuǎn)錄,啟動(dòng)子1(promoter 1,P1)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Runx1c和啟動(dòng)子2(promoter 2,P2)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Runx1b在造血發(fā)育中有明顯的表達(dá)差異,但其作用機(jī)制尚不清楚。我們的實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)Runx1變體在造血發(fā)育不同階段和位點(diǎn)的表達(dá)為出發(fā)點(diǎn),闡述RUNX1對(duì)造血發(fā)育和造血微環(huán)境的調(diào)控并初步探討其作用機(jī)制。 為了研究小鼠造血發(fā)育過(guò)程中Ex5和ΔEx5兩種剪接體的表達(dá)差異,分離小鼠E7.5-11.5 (embryonic day 7.5-11.5)不同造血組織AGM區(qū)、卵黃囊(yolk sac, YS),通過(guò)RT-PCR檢測(cè)AGM區(qū)和YS在此發(fā)育階段內(nèi)兩種剪接體的表達(dá)差異情況。結(jié)果表明:E7.5-11.5YSΔEx5表達(dá)高于Ex5,但無(wú)明顯變化趨勢(shì);E8.5-11.5AGM區(qū)中,ΔEx5 E8.5表達(dá)占優(yōu)勢(shì),Ex5剪接體表達(dá)則逐漸升高。這說(shuō)明胚胎造血發(fā)育過(guò)程中RUNX1對(duì)造血細(xì)胞的調(diào)控功能可能主要由轉(zhuǎn)錄激活功能較強(qiáng)的Ex5剪接體實(shí)現(xiàn)。RT-PCR檢測(cè)E7.5-11.5時(shí)AGM區(qū)Runx1b和Runx1c表達(dá)發(fā)現(xiàn),在此發(fā)育過(guò)程中Runx1b表達(dá)較高;E11.5胚胎不同造血部位AGM區(qū)、YS、胎盤(placenta,PL)、胎肝(fetal liver,FL)以及成體骨髓(bone marrow,BM),RT-PCR結(jié)果顯示:E11.5胚胎AGM區(qū)Runx1b表達(dá)高于Runx1c,而在FL中Runx1c表達(dá)較高。分離成體小鼠骨髓貼壁細(xì)胞和懸浮的造血細(xì)胞,RT-PCR結(jié)果表明,貼壁細(xì)胞Runx1b表達(dá)高于Runx1c。由于小鼠骨髓貼壁細(xì)胞種類較復(fù)雜,我們通過(guò)進(jìn)一步培養(yǎng)獲得MSCs(mesenchymal stem cells,MSCs),結(jié)果發(fā)現(xiàn):小鼠BM MSCs中Runx1b表達(dá)較高。上述結(jié)果說(shuō)明:Runx1c主要在FL和成體的造血細(xì)胞表達(dá),可能與HSCs的分化有關(guān);而Runx1b在早期造血細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較高,暗示Runx1b除了直接調(diào)控早期造血發(fā)育外,還可能通過(guò)對(duì)造血微環(huán)境的調(diào)節(jié)而間接調(diào)控造血發(fā)育。 MSCs最早在BM中發(fā)現(xiàn),具有多向分化能力,體外特定條件下可分化產(chǎn)生脂肪、成骨及軟骨細(xì)胞。MSCs是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分,可以通過(guò)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞或分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的增殖和分化。在造血細(xì)胞中,RUNX1通過(guò)調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄活性對(duì)造血發(fā)育進(jìn)行調(diào)控,但RUNX1在MSCs中的調(diào)控效應(yīng)尚不明確。為檢測(cè)RUNX1在小鼠BM MSCs中的作用,探討RUNX1對(duì)造血微環(huán)境的調(diào)節(jié)機(jī)制,我們首先利用啟動(dòng)子分析軟件,發(fā)現(xiàn)Wnt5a和Runx2可能為RUNX1的下游靶基因。為了對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)實(shí)驗(yàn)研究Wnt5a、Runx2與RUNX1在體內(nèi)的相互作用關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RUNX1可與Wnt5a啟動(dòng)子區(qū)直接結(jié)合,而不能與Runx2啟動(dòng)子結(jié)合。為了進(jìn)一步研究RUNX1與Wnt5a轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系,從小鼠BM MSCs中克隆表達(dá)較高的Runx1b,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)使Runx1b在MSCs內(nèi)高表達(dá),驗(yàn)證小鼠BM MSCs中RUNX1b對(duì)Wnt5a的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Wnt5a的表達(dá)隨RUNX1b表達(dá)升高而增強(qiáng),這說(shuō)明在小鼠BM MSCs中,Wnt5a是RUNX1b直接的下游靶基因。 WNT5A(wingless-type MMTV integration site family, member 5A)是WNT家族的重要成員,主要參與WNT/Ca+信號(hào)通路。早期研究發(fā)現(xiàn)WNT5A可明顯促進(jìn)HSCs的擴(kuò)增,并能產(chǎn)生表型更原始、功能更強(qiáng)的子代細(xì)胞。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在小鼠BM MSCs脂肪分化體系中加入WNT5A細(xì)胞因子,MSCs脂肪分化受到明顯抑制,脂肪細(xì)胞特異表達(dá)產(chǎn)物Adipsin表達(dá)降低。為了檢測(cè)WNT5A對(duì)早期造血發(fā)育的影響,我們借助BL-CFC(blast colony-forming cell)模型,在BL-CFC培養(yǎng)體系中加入WNT5A細(xì)胞因子。BL-CFC在體外代表血液血管干細(xì)胞,可以向造血和內(nèi)皮細(xì)胞分化。結(jié)果表明,WNT5A可促進(jìn)BL-CFC集落的形成,并且集落的體積明顯增大。體外成血管實(shí)驗(yàn)表明,WNT5A可促進(jìn)BL-CFC的內(nèi)皮分化,這說(shuō)明WNT5A不但可以對(duì)MSCs自身發(fā)育起調(diào)控作用,還可以通過(guò)旁分泌的方式,調(diào)節(jié)早期的造血發(fā)育。 總之,本研究發(fā)現(xiàn),Runx1不同剪接體在小鼠造血發(fā)育不同階段和位點(diǎn)存在表達(dá)差異;小鼠BM MSCs高表達(dá)Runx1b,RUNX1通過(guò)促進(jìn)Wnt5a的轉(zhuǎn)錄抑制MSCs的脂肪分化能力。同時(shí)我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BL-CFC培養(yǎng)體系中加入WNT5A可以促進(jìn)BL-CFC的內(nèi)皮分化。這提示我們?cè)缙谠煅l(fā)育過(guò)程中,微環(huán)境內(nèi)的MSCs可能通過(guò)旁分泌的方式產(chǎn)生WNT5A,對(duì)早期造血發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。為下一步更深入研究RUNX1對(duì)造血發(fā)育的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張文娟;慢病毒介導(dǎo)豬HOXB4基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)的研究[D];吉林大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：2451047