【摘要】：RUNX1(runt-related transcription factor 1)是造血發(fā)育中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一,在胚胎和成體造血過程都發(fā)揮重要作用。在成體造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)分化過程中RUNX1主要參與調(diào)控多個HSCs增殖、分化相關(guān)基因的表達。RUNX1的缺失抑制巨核細胞的成熟和T、B淋巴細胞的分化,其突變或基因重排與白血病的發(fā)生有關(guān)。在胚胎造血發(fā)育中,RUNX1參與調(diào)控血液血管干細胞(hemangioblast)向HSCs分化,敲除Runx1基因?qū)е屡咛ケ持鲃用}-性腺-中腎(aorta-gonad-mesonephres region, AGM)區(qū)血管壁腹側(cè)無造血簇產(chǎn)生,而使永久造血(defenitive hematopoiesis)完全缺失。早期研究發(fā)現(xiàn),Runx1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在不同的發(fā)育階段存在可變剪接現(xiàn)象,剪接位點發(fā)生在外顯子5(Exon5)處,產(chǎn)生Ex5和ΔEx5兩種剪接體,ΔEx5剪接體因缺失外顯子5而使其表達產(chǎn)生的蛋白轉(zhuǎn)錄激活能力較低。同時,其基因上游存在兩個啟動子調(diào)控Runx1的轉(zhuǎn)錄,啟動子1(promoter 1,P1)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Runx1c和啟動子2(promoter 2,P2)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Runx1b在造血發(fā)育中有明顯的表達差異,但其作用機制尚不清楚。我們的實驗以檢測Runx1變體在造血發(fā)育不同階段和位點的表達為出發(fā)點,闡述RUNX1對造血發(fā)育和造血微環(huán)境的調(diào)控并初步探討其作用機制。 為了研究小鼠造血發(fā)育過程中Ex5和ΔEx5兩種剪接體的表達差異,分離小鼠E7.5-11.5 (embryonic day 7.5-11.5)不同造血組織AGM區(qū)、卵黃囊(yolk sac, YS),通過RT-PCR檢測AGM區(qū)和YS在此發(fā)育階段內(nèi)兩種剪接體的表達差異情況。結(jié)果表明:E7.5-11.5YSΔEx5表達高于Ex5,但無明顯變化趨勢;E8.5-11.5AGM區(qū)中,ΔEx5 E8.5表達占優(yōu)勢,Ex5剪接體表達則逐漸升高。這說明胚胎造血發(fā)育過程中RUNX1對造血細胞的調(diào)控功能可能主要由轉(zhuǎn)錄激活功能較強的Ex5剪接體實現(xiàn)。RT-PCR檢測E7.5-11.5時AGM區(qū)Runx1b和Runx1c表達發(fā)現(xiàn),在此發(fā)育過程中Runx1b表達較高;E11.5胚胎不同造血部位AGM區(qū)、YS、胎盤(placenta,PL)、胎肝(fetal liver,FL)以及成體骨髓(bone marrow,BM),RT-PCR結(jié)果顯示:E11.5胚胎AGM區(qū)Runx1b表達高于Runx1c,而在FL中Runx1c表達較高。分離成體小鼠骨髓貼壁細胞和懸浮的造血細胞,RT-PCR結(jié)果表明,貼壁細胞Runx1b表達高于Runx1c。由于小鼠骨髓貼壁細胞種類較復雜,我們通過進一步培養(yǎng)獲得MSCs(mesenchymal stem cells,MSCs),結(jié)果發(fā)現(xiàn):小鼠BM MSCs中Runx1b表達較高。上述結(jié)果說明:Runx1c主要在FL和成體的造血細胞表達,可能與HSCs的分化有關(guān);而Runx1b在早期造血細胞和基質(zhì)細胞中表達較高,暗示Runx1b除了直接調(diào)控早期造血發(fā)育外,還可能通過對造血微環(huán)境的調(diào)節(jié)而間接調(diào)控造血發(fā)育。 MSCs最早在BM中發(fā)現(xiàn),具有多向分化能力,體外特定條件下可分化產(chǎn)生脂肪、成骨及軟骨細胞。MSCs是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分,可以通過分化為成骨細胞和脂肪細胞或分泌多種細胞因子調(diào)節(jié)造血細胞的增殖和分化。在造血細胞中,RUNX1通過調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄活性對造血發(fā)育進行調(diào)控,但RUNX1在MSCs中的調(diào)控效應尚不明確。為檢測RUNX1在小鼠BM MSCs中的作用,探討RUNX1對造血微環(huán)境的調(diào)節(jié)機制,我們首先利用啟動子分析軟件,發(fā)現(xiàn)Wnt5a和Runx2可能為RUNX1的下游靶基因。為了對預測結(jié)果進行驗證,通過染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)實驗研究Wnt5a、Runx2與RUNX1在體內(nèi)的相互作用關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RUNX1可與Wnt5a啟動子區(qū)直接結(jié)合,而不能與Runx2啟動子結(jié)合。為了進一步研究RUNX1與Wnt5a轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系,從小鼠BM MSCs中克隆表達較高的Runx1b,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)使Runx1b在MSCs內(nèi)高表達,驗證小鼠BM MSCs中RUNX1b對Wnt5a的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Wnt5a的表達隨RUNX1b表達升高而增強,這說明在小鼠BM MSCs中,Wnt5a是RUNX1b直接的下游靶基因。 WNT5A(wingless-type MMTV integration site family, member 5A)是WNT家族的重要成員,主要參與WNT/Ca+信號通路。早期研究發(fā)現(xiàn)WNT5A可明顯促進HSCs的擴增,并能產(chǎn)生表型更原始、功能更強的子代細胞。我們的實驗發(fā)現(xiàn)在小鼠BM MSCs脂肪分化體系中加入WNT5A細胞因子,MSCs脂肪分化受到明顯抑制,脂肪細胞特異表達產(chǎn)物Adipsin表達降低。為了檢測WNT5A對早期造血發(fā)育的影響,我們借助BL-CFC(blast colony-forming cell)模型,在BL-CFC培養(yǎng)體系中加入WNT5A細胞因子。BL-CFC在體外代表血液血管干細胞,可以向造血和內(nèi)皮細胞分化。結(jié)果表明,WNT5A可促進BL-CFC集落的形成,并且集落的體積明顯增大。體外成血管實驗表明,WNT5A可促進BL-CFC的內(nèi)皮分化,這說明WNT5A不但可以對MSCs自身發(fā)育起調(diào)控作用,還可以通過旁分泌的方式,調(diào)節(jié)早期的造血發(fā)育。 總之,本研究發(fā)現(xiàn),Runx1不同剪接體在小鼠造血發(fā)育不同階段和位點存在表達差異;小鼠BM MSCs高表達Runx1b,RUNX1通過促進Wnt5a的轉(zhuǎn)錄抑制MSCs的脂肪分化能力。同時我們的實驗發(fā)現(xiàn)BL-CFC培養(yǎng)體系中加入WNT5A可以促進BL-CFC的內(nèi)皮分化。這提示我們早期造血發(fā)育過程中,微環(huán)境內(nèi)的MSCs可能通過旁分泌的方式產(chǎn)生WNT5A,對早期造血發(fā)育進行調(diào)控。為下一步更深入研究RUNX1對造血發(fā)育的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【引證文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 張文娟;慢病毒介導豬HOXB4基因在骨髓間充質(zhì)干細胞中表達的研究[D];吉林大學;2013年

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本文編號：2451047