【摘要】：第一部分MsrA及其功能調(diào)節(jié)劑對(duì)線粒體氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及機(jī)制 目的：活性氧(ROS)的積累是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的致病因子之一。線粒體是其中最易受氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞器之一。蛋氨酸亞砜還原酶A(MsrA)介導(dǎo)的“蛋氨酸氧化-還原循環(huán)”是細(xì)胞中重要的抗氧化應(yīng)激機(jī)制,具有很強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用。本研究探討MsrA及其小分子功能調(diào)節(jié)劑L-蛋氨酸對(duì)過氧化氫(H202)誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷的保護(hù)作用。 方法：質(zhì)粒構(gòu)建,細(xì)胞培養(yǎng),熒光成像,氧化應(yīng)激造模,MTT染色,Western Blotting,電鏡觀察,線粒體膜電位檢測(cè),線粒體超氧化物檢測(cè)。 結(jié)果：熒光成像實(shí)驗(yàn)顯示MsrA與線粒體共定位。過表達(dá)MsrA或給予L-蛋氨酸(0.5-1mM)均可減輕H202誘導(dǎo)的線粒體膜電位變化和超微結(jié)構(gòu)變化,以及超氧化物的生成。局部預(yù)先給予L-蛋氨酸可減輕佛波酯(TPA)誘導(dǎo)的小鼠皮膚氧化性損傷。 結(jié)論：給予參與MsrA催化抗氧化循環(huán)的小分子化合物可能是預(yù)防氧化應(yīng)激損傷的新策略。 第二部分MsrA及其功能調(diào)節(jié)劑對(duì)線粒體呼吸鏈抑制劑MPP+所致神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制 目的：MsrA作為一種參與線粒體保護(hù)的重要抗氧化酶,近年來被認(rèn)為和衰老相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。MsrA對(duì)于Ap、缺氧和6-OHDA引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷都具有保護(hù)作用。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPP+)是一種線粒體呼吸鏈阻斷劑,也是最常用的建立帕金森病(PD)細(xì)胞模型的神經(jīng)毒素。本研究探討基因重組蛋白Tat-rMsrA及其小分子功能調(diào)節(jié)劑L-蛋氨酸(L-Met)、硫甲基-L-半胱氨酸(SMLC)對(duì)MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。 方法：SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng),Western Blotting,免疫組化,活性氧熒光染色,Tat-rMsrA的克隆和重組蛋白表達(dá)及純化,MTT染色,PI染色。 結(jié)果：衰老鼠中黑質(zhì)、紋狀體等PD相關(guān)腦區(qū)中MsrA的表達(dá)減少。基因重組蛋白Tat-rMsrA可進(jìn)入SH-SY5Y細(xì)胞,并減少M(fèi)PP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。L-Met和SMLC減少SH-SY5Y細(xì)胞中的活性氧熒光,并減輕過氧化氫和MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。 結(jié)論：MsrA及其功能調(diào)節(jié)劑對(duì)MPP+引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與其降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平有關(guān)。 第三部分基因重組Tat-hMsrA的中試工藝路線研究 目的：MsrA是一種很好的抗氧化酶和蛋白修復(fù)酶,在體內(nèi)扮演多種角色,與多種疾病和皮膚衰老密切相關(guān),如：白內(nèi)障、白癜風(fēng)、光老化等等。MsrA可以像SOD一樣添加到化妝品、保健品和藥品當(dāng)中,因此具有非常好的應(yīng)用前景。我們合成了人源性重組蛋白Tat-hMsrA.本實(shí)驗(yàn)擬探討基因重組Tat-hMsrA的中試工藝路線,為將基因重組Tat-hMsrA的產(chǎn)業(yè)化打下良好的基礎(chǔ)。 方法：感受肽細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化,基因的表達(dá)與檢測(cè),包涵體蛋白純化及復(fù)性,親和層析純化,融合蛋白酶切,無his標(biāo)簽蛋白純化,真核質(zhì)粒的構(gòu)建。 結(jié)果：使用基因工程的方法構(gòu)建了原核pet32a-Tat-hMsrA質(zhì)粒,并從BL21(DE3),gammi, rosseta, gold篩選出最合適的宿主菌BL21(DE3),然后進(jìn)行蛋白的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),發(fā)現(xiàn)蛋白主要在包涵體表達(dá)。然后進(jìn)行蛋白的變形和復(fù)性,從包涵體得到純化蛋白,檢測(cè)后無活性。融合蛋白在上清的表達(dá)量極低,放大工藝受阻。我們轉(zhuǎn)而開始構(gòu)建真核酵母表達(dá)質(zhì)粒ppic9k,電轉(zhuǎn)化gs115宿主,進(jìn)一步摸索中試工藝。 結(jié)論：利用原核大腸桿菌BL21來表達(dá)人源性的重組融合蛋白Tat-hMsrA,無法進(jìn)行工藝放大,因此原核發(fā)酵系統(tǒng)不適于Tat-hMsrA的中試放大,真核發(fā)酵系統(tǒng)可能較為適合。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2448963