【摘要】：禽流感是由A型流感病毒引起的禽類傳染病,近十年來(lái),以H5N1型為代表的高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza, HPAI)肆虐全球,不僅給世界養(yǎng)禽業(yè)造成損失,甚至出現(xiàn)了越來(lái)越多的人感染H5N1型禽流感致死病例,已有人傳人禽流感病例的報(bào)道[5-6]。由于人體內(nèi)沒有針對(duì)禽流感病毒的抗體,特別是針對(duì)H5抗原的抗體,所以人感染H5N1型禽流感病毒后具有較高的致死率,對(duì)人類健康和世界公共衛(wèi)生安全已構(gòu)成重大威脅。目前針對(duì)人間H5N1型禽流感大流行的防控措施主要有兩種,一是疫苗[10-11],但由于流感病毒不同毒株間存在抗原差異且變異頻繁[12],使得新開發(fā)的疫苗往往滯后于疫情暴發(fā)[13]。二是化學(xué)藥物,主要包括M2蛋白阻滯劑,如金剛烷胺和金剛乙胺；神經(jīng)氨酸酶抑制劑,如奧司他韋和扎那米韋等。但化學(xué)藥物過(guò)量使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性和容易引起服用者精神異常等副作用[16-17]。作為疫苗和化學(xué)藥物的有效補(bǔ)充,由抗體介導(dǎo)的預(yù)防和臨床治療措施已顯現(xiàn)良好的效果,其應(yīng)用前景得到專家的認(rèn)同[18-19]。因此,研發(fā)人源化或全人源基因工程抗體用于禽流感臨床治療具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建全人源抗H5N1型禽流感病毒免疫型scFv噬菌體抗體庫(kù),篩選具有廣譜中和活性的scFv抗體,并對(duì)其保守中和表位進(jìn)行分析,為H5N1型禽流感的防治提供一個(gè)候選抗體藥物,也為亞單位疫苗的研制提供新的思路。研究方法 1.構(gòu)建全人源抗H5N1型禽流感病毒免疫型scFv噬菌體抗體庫(kù) 取40位經(jīng)H5N1型禽流感疫苗免疫志愿者的外周血淋巴細(xì)胞,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA；用人源特異性抗體引物擴(kuò)增VH、Vκ、Vλ基因,再經(jīng)過(guò)重疊PCR制備scFv基因；將scFv片段與pComb3XSS同時(shí)經(jīng)SfiI酶切、連接后電轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coli XL1-Blue,加入輔助噬菌體VCSM13過(guò)夜培養(yǎng),上清經(jīng)PEG8000/NaCl沉淀,制備抗H5N1型禽流感病毒免疫型scFv噬菌體抗體庫(kù)。 2.桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA1亞基 以A/Jiangsu/1/2007(H5N1)為模板,提取病毒基因組RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,擴(kuò)增HA1基因,酶切產(chǎn)物與重組質(zhì)粒pFastBac連接篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒；陽(yáng)性克隆進(jìn)一步轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞獲得陽(yáng)性重組子HAl-rBacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,待細(xì)胞病變后收集重組病毒液,經(jīng)傳代后制備高滴度病毒溶液并進(jìn)一步感染Sf9細(xì)胞,72h后分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞沉淀,Western blot檢測(cè)重組蛋白HA1的表達(dá),親和柱純化HA1蛋白,SDS-PAGE電泳檢測(cè)及質(zhì)譜鑒定。 3.HA1特異性scFv抗體的篩選及表達(dá) 以純化的重組H5N1型禽流感病毒HA1蛋白包被酶標(biāo)板,加入擴(kuò)增的抗體庫(kù)孵育,依次進(jìn)行三輪“吸附一洗脫一擴(kuò)增”富集篩選,從第三輪篩選后得到的細(xì)菌集落中隨機(jī)挑選單克隆,制備噬菌體抗體,并用phage-ELISA鑒定。陽(yáng)性克隆經(jīng)序列分析后,進(jìn)行可溶性抗體表達(dá)、純化和特異性鑒定。 4.具有廣譜中和活性的scFv抗體的鑒定及中和表位分析 MDCK細(xì)胞微量中和試驗(yàn)、Western blot、間接免疫熒光、血凝抑制試驗(yàn)等對(duì)純化的scFv抗體進(jìn)行鑒定篩選出具有廣譜中和活性的抗體；應(yīng)用噬菌體肽庫(kù),結(jié)合蛋白3D結(jié)構(gòu)模型及點(diǎn)突變檢測(cè)技術(shù)分析中和抗體與HA蛋白的結(jié)合表位。 5.中和性scFv抗體對(duì)H5N1型禽流感病毒感染雞胚的保護(hù)作用 H5N1型禽流感病毒感染10日齡雞胚,分別進(jìn)行雞胚預(yù)防和治療試驗(yàn)。雞胚預(yù)防試驗(yàn),首先給雞胚注射25、50、75、100、200μg/kg scFv抗體,30min后再給雞胚注射10LD50的病毒。雞胚治療試驗(yàn),首先給雞胚注射給10LD50的病毒,1h后,給雞胚注射100、150、200、250、500μg/kg scFv抗體,觀察各組雞胚8d后的存活情況,計(jì)算各組抗體的保護(hù)率。研究結(jié)果 1.構(gòu)建免疫型scFv噬菌體抗體庫(kù)：采用噬菌體展示技術(shù),經(jīng)2輪PCR擴(kuò)增得到scFv基因片段約750bp,100次電轉(zhuǎn)化后導(dǎo)入E.coli XL1-Blue中,構(gòu)建了庫(kù)容為6.0×108的全人源抗H5N1型禽流感病毒免疫型scFv噬菌體抗體庫(kù)。 2.重組蛋白HAl的表達(dá)：將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pFastBac-HA1雙酶切后,含有pFastBac(4700bp)和HA1(1000bp)兩個(gè)帶；用M13通用引物對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒HA1-rBacmid進(jìn)行PCR鑒定,擴(kuò)增的片段大小為3400bp,與預(yù)期相符；將HA1-rBacmid病毒種子液以10倍感染復(fù)數(shù)接種Sf9細(xì)胞,Western blot表明在培養(yǎng)上清和細(xì)胞沉淀中均有重組蛋白HA1的表達(dá)。SDS-PAGE顯示純化后的重組蛋白分子量大小為43kD,即為HA1蛋白的大小。質(zhì)譜鑒定結(jié)果證明表達(dá)的蛋白與H5N1型禽流感病毒的HA1蛋白的同源性最高。 3.噬菌體抗體的篩選及可溶性抗體的表達(dá)：以純化的HA1為抗原,從scFv噬菌體抗體庫(kù)中篩選特異性抗體,隨機(jī)挑取的564個(gè)克隆經(jīng)鑒定25個(gè)克隆能與HA1蛋白特異性結(jié)合；經(jīng)測(cè)序分析,篩選出9株序列不同的scFv抗體,可溶性表達(dá)后利用His親和層析柱純化scFv抗體。 4.scFv抗體中和活性的鑒定及序列分析：9株scFv抗體分別與100TCID50的6株不同clade的H5N1型禽流感病毒混合孵育后加入MDCK細(xì)胞中,3d后檢測(cè)細(xì)胞病變,其中4株scFv抗體(3D1、3F5、4F5、6F9)可與6株病毒起中和反應(yīng),證明它們具有廣譜的中和活性,中和反應(yīng)濃度(IC50)從0.39-45μg/ml。 4株scFv抗體與病毒株進(jìn)行Western blot檢測(cè),6株病毒均能檢測(cè)到70kD、43kD的2條帶,分別為HA0及HA1蛋白的大小,證明scFv識(shí)別的抗原決定簇在HA1亞基上；免疫熒光可見各株病毒感染后的細(xì)胞有特異性紅色熒光；4株scFv抗體分別與6株病毒孵育后均能引起雞紅細(xì)胞血凝抑制,血凝抑制活性HI與IC50成正相關(guān),進(jìn)一步證明scFv識(shí)別的結(jié)合位點(diǎn)在HA1亞基。 測(cè)序顯示4株scFv抗體HCDRs區(qū)氨基酸序列完全相同,對(duì)其中的3株進(jìn)行HRP標(biāo)記并進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè),結(jié)果表明4株scFv抗體與重組HA1蛋白結(jié)合時(shí)存在相互競(jìng)爭(zhēng)作用,從而證明它們結(jié)合的是HA1蛋白的同一表位。 5.廣譜中和活性scFv抗體保守中和表位的分析：4株scFv抗體混合液包被ELISA板進(jìn)行噬菌體肽庫(kù)的篩選,20個(gè)隨機(jī)克隆中有18個(gè)含有共同的WLLP氨基酸序列,與6株病毒的HA序列第76-81位氨基酸WLLGNP相似,推測(cè)其可能是scFv抗體與HA蛋白的結(jié)合位點(diǎn)；利用蛋白結(jié)構(gòu)軟件預(yù)測(cè)scFv抗體的結(jié)合位點(diǎn)位于HA的E抗原區(qū)附近,WLLGNP也位于此區(qū)域；將WLLGNP突變?yōu)閃RRGNP后重新轉(zhuǎn)入桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),scFv抗體無(wú)法識(shí)別突變的HA1蛋白,進(jìn)一步證明WLLGNP為4株scFv抗體的結(jié)合表位。 6. scFv抗體對(duì)H5N1型禽流感病毒感染雞胚的預(yù)防和治療保護(hù)作用：預(yù)防試驗(yàn)結(jié)果表明,scFv抗體對(duì)禽源和人源H5N1型禽流感病毒的保護(hù)率均可達(dá)100%；治療試驗(yàn)結(jié)果表明,scFv抗體對(duì)禽來(lái)源的H5N1型禽流感病毒的感染具有100%保護(hù)率,對(duì)人源的H5N1型禽流感病毒也可產(chǎn)生62.5%的保護(hù)率。結(jié)論 1.利用噬菌體展示技術(shù)成功構(gòu)建了庫(kù)容量為6.0x108的全人源抗H5N1型禽流感病毒免疫型scFv噬菌體抗體庫(kù),為篩選全人源抗H5N1型禽流感病毒抗體奠定了基礎(chǔ)； 2.篩選獲得具有廣譜中和活性的全人源scFv抗體4株,明確了保守的中和表位WLLGNP,為亞單位疫苗的研制提供新的思路。 3.中和活性scFv抗體對(duì)病毒感染的雞胚具有較好的保護(hù)作用,該抗體的獲得不僅為H5N1型禽流感的防治提供一個(gè)候選抗體藥物,也為H5N1型高致病性禽流感病毒的預(yù)防和治療帶來(lái)了希望。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.11

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;Expression and bioactivity identification of soluble MG_7 scFv[J];World Journal of Gastroenterology;2002年01期

2 鐘小林,高會(huì)廣,吉清,黃剛;一種可溶性單抗ScFv片段的表達(dá)及鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年08期

3 劉靜;肖代雯;周小鷗;文雪;代紅;王志華;沈昕;代維;楊道鋒;沈關(guān)心;;Preparation and Identification of scFv and bsFv against Transferrin Receptor[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2008年06期

4 馬巍娜;賈雷立;劉雪林;宋宏彬;高志賢;鐘彥偉;張傳福;徐元勇;;抗鹽酸克倫特羅人源ScFv抗體篩選與鑒定[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2009年03期

5 胡川閩;李鵬;陳安;郭建秀;劉彥仿;;抗人肝癌單鏈抗體HAb25-scFv的構(gòu)建及其表達(dá)[J];免疫學(xué)雜志;2005年06期

6 夏勁松;畢昊;姚琴;屈伸;宗義強(qiáng);;Construction of Human ScFv Phage Display Library against Ovarian Tumor[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2006年05期

7 管海宏,付萌,李巍,夏汝山,王剛,劉玉峰;天然抗角蛋白單克隆抗體3B4的噬菌體呈現(xiàn)的scFv的構(gòu)建及表達(dá)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2005年04期

8 唐彩華;肖錫賓;吳濤;梁昌盛;劉長(zhǎng)征;;BAC_5-scFv的表達(dá)、復(fù)性及活性檢測(cè)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2006年01期

9 秦娜;;丙溴磷人源ScFv抗體的篩選與鑒定[J];太原師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年02期

10 劉春雨;崔恒;昌曉紅;葉雪;付天云;程洪艷;張果;熊英;成夜霞;張麗;趙e，

本文編號(hào)：2448813