【摘要】：目的 檢測心肌微環(huán)境下,骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)向心肌細胞(CM)轉分化過程中組蛋白去乙�；�1(HDAC1)的時相表達,初步探討成體干細胞定向轉分化的乙�；{(diào)控機制。 方法 1.采用全骨髓貼壁法體外分離、培養(yǎng)、純化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),當細胞達80-90%融合時,用胰酶-EDTA(0.25%:0.05%)消化細胞進行傳代培養(yǎng)。取第3代細胞進行流式細胞術細胞表面標記檢測,并誘導BMSCs向成骨細胞、成脂肪細胞分化。茜素紅染色鑒定BMSCs成骨分化的能力,油紅O染色鑒定BMSCs成脂肪分化的能力。 2. 293A細胞培養(yǎng),當細胞達50-70%融合時,用0.25%胰酶消化細胞,以1:10-1:20傳代擴增培養(yǎng)。 3. Ad-EGFP以MOI 100轉染90-100%融合的293A細胞進行病毒擴增,轉染3天后,細胞出現(xiàn)病變效應,收集細胞。 4. Ad-EGFP以MOI 0、10、50、100、200、400轉染BMSCs,流式細胞術檢測轉染效率,并得出最佳轉染效率的MOI值。 5.新生乳鼠心肌細胞(cardiomyocytes,CM)分離、培養(yǎng),72 h后免疫熒光染色法鑒定心肌肌鈣蛋白T(CTnT)的表達情況。 6.將Ad-EGFP轉染后的BMSCs與CM以1:1比例直接接觸共培養(yǎng)。 7.依據(jù)共培養(yǎng)的時間,將實驗分為六組,即BMSCs組(空白對照組)、共培養(yǎng)3天、6天、9天、12天組、心肌細胞(CM)組,收集細胞(1×107),流式細胞儀488 nm波長分選EGFP+BMSCs。 8.免疫熒光染色法檢測EGFP+BMSCs中心臟肌鈣蛋白T(CTnT)的表達。 9. FQ-PCR檢測組蛋白去乙�；�1(histone deacetylase 1,HDAC1)的mRNA表達。 10. Western Blot檢測組蛋白去乙�；�1(HDAC1)的蛋白表達。 11.數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差( x±s)表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組之間比較采用單因素方差分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果 1.原代及傳代的骨髓間充質(zhì)干細胞均呈成纖維細胞樣的長梭形,第3代骨髓間充質(zhì)干細胞不表達造血標志CD34(3.04%)、CD45(1.14%) ,強表達CD29 (99.86%)、CD44 (99.28%)、CD90(99.74%)等基質(zhì)細胞/間質(zhì)細胞表面標志。成骨誘導21 d后,可見大量橘紅色礦化結節(jié)形成。成脂誘導2-3周后,可見細胞的胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量紅染脂滴。 2. 293A細胞貼壁后呈成纖維細胞樣,Ad-EGFP轉染293A細胞第3天,細胞變圓、脫落,呈葡萄串樣聚集,熒光顯微鏡下觀察,293A細胞發(fā)出綠色熒光。 3. EGFP在Ad-EGFP轉染BMSCs 24 h后開始表達,72 h后達到峰值。MOI 10-100時,轉染效率不足60%;MOI 400時,轉染效率達80-85%,但BMSCs出現(xiàn)細胞病理效應(CPE);MOI 200時,細胞無明顯形態(tài)改變,轉染效率近80%。 4.心肌細胞分離培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)自主收縮,呈三角形或扁平不規(guī)則形,72 h后,免疫熒光染色提示心臟肌鈣蛋白T(CTnT)陽性率達90%以上。 5. BMSCs與CM共培養(yǎng)2-3天后,可見與CM直接接觸的長梭形BMSCs逐漸縮短、增粗,4-5天后熒光顯微鏡下顯示部分EGFP+BMSCs表達CTnT,12天后終止共培養(yǎng)實驗,未見EGFP+BMSCs自發(fā)搏動。流式細胞術檢測分選的EGFP+BMSCs陽性率可達97%以上。 6. HDAC1 mRNA在各組標本均有表達,在共培養(yǎng)3天、6天、9天、12天4個時點組和CM組中的表達量均顯著低于對照(BMSCs)組,P0.05,BMSCs組中的HDAC1 mRNA的表達量約是CM組的14倍。 7.與對照組(BMSCs組)比較, HDAC1蛋白的表達水平在共培養(yǎng)3天、6天、 9天組有明顯降低(P0.05),BMSCs組中HDAC1蛋白的表達量約是CM組的8倍。 結論HDAC1負性調(diào)節(jié)微環(huán)境下BMSCs向心肌細胞的轉分化。
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【學位授予單位】：廣州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2448685