【摘要】：肥胖癥是指由于體內(nèi)脂肪蓄積過(guò)多或者分布不均勻而導(dǎo)致的一種病狀,它是由于機(jī)體能量的攝入量長(zhǎng)期超過(guò)消耗量,進(jìn)而導(dǎo)致體重增加的一種疾病。研究顯示,肥胖癥可以引發(fā)機(jī)體多種疾病,或者增加機(jī)體多種疾病的發(fā)病率,如冠心病、高血壓及心血管疾病等。預(yù)防和控制肥胖是避免多種代謝疾病的關(guān)鍵。 研究發(fā)現(xiàn),肥胖癥的發(fā)生是生理、生化及生活方式等多個(gè)因素共同作用的結(jié)果。脂肪組織在肥胖癥的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用。脂肪細(xì)胞分化是正常體內(nèi)脂肪貯存的生理基礎(chǔ),也是肥胖發(fā)生的病理基礎(chǔ)。肥胖的核心環(huán)節(jié)在于脂肪細(xì)胞的過(guò)度分化與體積的增大,生成了過(guò)多功能失調(diào)的脂肪細(xì)胞。因此,脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及凋亡的分子調(diào)控機(jī)制正成為肥胖及其相關(guān)疾病研究的熱點(diǎn)。 脂肪細(xì)胞起源于中胚層的多能干細(xì)胞,該多能干細(xì)胞是成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的共同前體細(xì)胞。雖然目前決定該多能干細(xì)胞定向分化成為脂肪前體細(xì)胞的具體機(jī)制尚未明確,但是,人們得知該多能干細(xì)胞能夠在特定條件下定向分化為脂肪前體細(xì)胞,進(jìn)而分化為成熟脂肪細(xì)胞。脂肪前體細(xì)胞分化為成熟脂細(xì)胞的具體調(diào)控機(jī)制也沒(méi)完全清楚,但已有不少報(bào)道。研究證明,脂肪細(xì)胞分化成熟的過(guò)程實(shí)際上是一系列脂肪細(xì)胞特異性基因差次表達(dá)的復(fù)雜過(guò)程。 促甲狀腺素受體(Thyroid-stimulating hormone receptor, TSHR)在甲狀腺以外組織的表達(dá),包括在脂肪組織中的表達(dá),已經(jīng)得到證實(shí),且發(fā)現(xiàn)它是具有一定的生物學(xué)功能的。但是,關(guān)于TSHR在脂肪前體細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞中的具體作用尚未明確,關(guān)于TSHR與肥胖癥之間的關(guān)聯(lián)報(bào)道甚少。因此,進(jìn)一步深入探討TSHR在脂肪形成過(guò)程中的調(diào)控作用、分子機(jī)制及其與肥胖癥的關(guān)聯(lián)對(duì)于臨床預(yù)防和控制肥胖癥意義重大。實(shí)驗(yàn)工作分以下三部分開(kāi)展： 第一部分促甲狀腺素受體(TSHR)的表達(dá)在脂肪細(xì)胞分化中的動(dòng)態(tài)變化及作用 研究目的：探討促甲狀腺素受體(Thyroid-stimulating hormone receptor, TSHR)的表達(dá)在脂肪前體細(xì)胞3T3-L1和3T3-F442A體外分化為成熟脂肪細(xì)胞過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及作用。 研究?jī)?nèi)容： 1、借助于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),以體外培養(yǎng)的脂肪前體細(xì)胞3T3-L1和3T3-F442A為實(shí)驗(yàn)材料,誘導(dǎo)分化為相應(yīng)的成熟脂肪細(xì)胞。用油紅O染色法鑒定脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的形成,并經(jīng)異丙醇萃取后于紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)汕紅O在510nm處的吸光度值。 2、收集誘導(dǎo)分化不同時(shí)間(第0,2,4,6,8,10及12天)的脂肪細(xì)胞,分別進(jìn)行RNA及蛋白質(zhì)的提取,以反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)和蛋白印跡技術(shù)(Western Blot)檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志分子過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor y, PPAR y)和脂肪細(xì)胞脂類結(jié)合蛋白(adipocyte lipid binding protein, ALBP)在脂肪細(xì)胞形成過(guò)程中mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。 3、以上述所獲得的誘導(dǎo)分化不同時(shí)期的脂肪細(xì)胞RNA及蛋白質(zhì)為材料,用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)Tshr在脂肪細(xì)胞形成過(guò)程中mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。 4、借助于免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法,采用倒置相差熒光顯微鏡檢測(cè)脂肪前體細(xì)胞及成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)Tshr的表達(dá)情況。 5、設(shè)計(jì)靶向小鼠Tshr基因的shRNA序列,構(gòu)建重組慢病毒載體LV3/Tshr-shRNA(以LV3/NC為陰性對(duì)照),經(jīng)293T細(xì)胞包裝病毒后感染脂肪前體細(xì)胞3T3-F442A,篩選出穩(wěn)定干擾Tshr蛋白表達(dá)的3T3-F442A單細(xì)胞克隆,以油紅O染色、RT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測(cè)Tshr表達(dá)變化對(duì)脂肪前體細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化敏感性的影響。 6、用不同濃度(0,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0μM)牛促甲狀腺素(bovine thyroid-stimulating hormone, bTSH)刺激3T3-F442A脂肪前體細(xì)胞以及其相應(yīng)的成熟脂肪細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)含量的變化。 7、用兩種濃度的bTSH (0.2μM,2μM)刺激處于誘導(dǎo)分化過(guò)程中的脂肪前體細(xì)胞3T3-F442A,檢測(cè)bTSH對(duì)胰島素誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的影響,并分析其可能的機(jī)制。細(xì)胞分為四組：第一組：對(duì)照組,細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清-DMEM (10%FBS-DMEM)培養(yǎng)基中,每2-3天更新培養(yǎng)基一次,不作其他任何處理；第二組：誘導(dǎo)分化組,細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)方法中所述進(jìn)行誘導(dǎo)使其向成熟脂肪細(xì)胞分化；第三組：bTSH低濃度(0.2μM)作用組,細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)方法中所述進(jìn)行誘導(dǎo)使其向成熟脂肪細(xì)胞分化,在加入誘導(dǎo)分化因子的同時(shí)加入bTSH至終濃度0.2μM；第四組：bTSH高濃度(2μM)作用組,細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)方法中所述進(jìn)行誘導(dǎo)使其向成熟脂肪細(xì)胞分化,在加入誘導(dǎo)分化因子的同時(shí)加入bTSH至終濃度2μM。對(duì)上述四組處于誘導(dǎo)分化不同時(shí)間(第0,2,4,8,12,14,16天)的細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色,異丙醇萃取后檢測(cè)510nm吸光度值的變化,對(duì)比同期誘導(dǎo)分化的不同處理組細(xì)胞間的甘油三酯生成含量。收集上述四組細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同時(shí)間(第2,4,8,12,16天)的蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè),檢測(cè)ERK及JNK磷酸化水平變化,以分析bTSH對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響機(jī)制。 8、使用兩種濃度的bTSH (0.2μM,2μM)刺激3T3-F442A成熟脂肪細(xì)胞,檢測(cè)bTSH對(duì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶(external-signal regulated kinase, ERK)及c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)磷酸化水平的影響,以期明確Tshr在脂肪細(xì)胞分化中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 研究結(jié)果： 1、光鏡下可見(jiàn)3T3-L1和3T3-F442A脂肪前體細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有甘油三酯聚積,油紅O染色不著色。脂肪前體細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)分化后,可見(jiàn)脂肪前體細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓,胞漿內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)脂滴,為油紅O染色著色,且隨著分化程度的增強(qiáng),脂滴逐漸變大且增多,油紅O染色著色加深,OD510nm檢測(cè)結(jié)果也顯示吸光度值隨細(xì)胞誘導(dǎo)分化程度的增強(qiáng)逐漸增加,至誘導(dǎo)分化第12天可見(jiàn)90%以上細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型,大量脂滴聚積。 2、RT-PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中,PPARγ和ALBP mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平隨分化程度的增強(qiáng)逐漸升高,與未分化組細(xì)胞(誘導(dǎo)分化第0天)相比較,自誘導(dǎo)分化第4天始,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)皆明顯升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3、在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中,Tshr蛋白質(zhì)表達(dá)水平隨細(xì)胞分化程度的增強(qiáng)逐漸升高,與未分化組細(xì)胞(誘導(dǎo)分化第0天)相比較,3T3-L1自誘導(dǎo)分化第4天后都明顯升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；3T3-F442A在誘導(dǎo)分化后第2天出現(xiàn)一個(gè)表達(dá)的小峰值(P0.05),隨后自誘導(dǎo)分化第4天表達(dá)水平逐漸增加且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示,3T3-L1和3T3-F442A成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)Tshr蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)的脂肪前體細(xì)胞。 5、對(duì)篩選出的靶向干擾Tshr表達(dá)的3T3-F442A脂肪前體細(xì)胞單克隆進(jìn)行RT-PCR和Western Blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)我們所選Tshr siRNA序列能夠有效干擾Tshr mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá),其中mRNA干擾程度為(60.73±5.56)%,蛋白質(zhì)干擾程度為(71.33±7.02)%。體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾Tshr表達(dá)降低了脂肪細(xì)胞分化成熟的程度,與未干擾組及陰性對(duì)照組細(xì)胞相比較,干擾Tshr表達(dá)組細(xì)胞在誘導(dǎo)分化第12天表現(xiàn)出顯著降低的OD510nm值(P0.05),且同期的PPARy和ALBP mRNA及蛋白表達(dá)水平較空載體組細(xì)胞有所下調(diào),尤其是誘導(dǎo)分化14天,下調(diào)顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 6、用不同濃度bTSH (0,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0μM)刺激3T3-F442A脂肪前體細(xì)胞以及其相應(yīng)的成熟脂肪細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)隨著bTSH濃度增加cAMP含量增加,表明脂肪前體細(xì)胞和脂肪細(xì)胞上的Tshr均有受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特性或生物學(xué)功能。 7、用bTSH (0.2μM,2μM)刺激處于誘導(dǎo)分化過(guò)程中的3T3-F442A脂肪前體細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)引入bTSH (0.2μM,2μM的實(shí)驗(yàn)組中脂肪細(xì)胞分化成熟的速度較同期下降,尤其是分化第12天,與單純誘導(dǎo)分化組相比,油紅O含量(OD510nm)下降顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。且bTSH(0.2μM,2μM)對(duì)胰島素引起的ERK和JNK的磷酸化水平有所降低,提示bTSH在脂肪細(xì)胞體外分化過(guò)程中有一定的抑制作用,其機(jī)制可能與干擾胰島素信號(hào)通路(如JNK, ERK磷酸化)有關(guān)。 8、用bTSH (0.2μM,2μM)刺激成熟的3T3-F442A脂肪細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)JNK, ERK的磷酸化水平均增加,下游靶分子c-Jun磷酸化水平也增加,尤其在bTSH(2μM)刺激組內(nèi),JNK, ERK磷酸化水平增加顯著(P0.05),說(shuō)明在成熟脂肪細(xì)胞中bTSH可激活ERK與JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 研究結(jié)論： 通過(guò)本部分實(shí)驗(yàn)的實(shí)施我們得出以下結(jié)論： 1、在3T3-L1和3T3-F442A脂肪前體細(xì)胞體外分化過(guò)程中,Tshr表達(dá)隨著分化程度的加重而逐漸升高； 2、干擾3T3-F442A脂肪前體細(xì)胞中Tshr的表達(dá),其體外分化過(guò)程受到一定程度的抑制； 3、較高濃度的bTSH刺激能夠抑制脂肪細(xì)胞的早期分化,其機(jī)制可能與干擾胰島素信號(hào)通路(如JNK, ERK磷酸化)有關(guān)。第二部分促甲狀腺素受體(TSHR)的表達(dá)與肥胖癥的關(guān)聯(lián) 研究目的：探討促甲狀腺素受體(TSHR)的表達(dá)與肥胖癥的關(guān)聯(lián)。 研究?jī)?nèi)容： 1、建立肥胖癥動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)： 選用8周齡雄性C57/BL6小鼠為實(shí)驗(yàn)材料,隨機(jī)分為兩組,以基礎(chǔ)飼料(脂肪含量5%)喂養(yǎng)組為對(duì)照組,用高脂飼料(脂肪含量20%)喂養(yǎng)組為模型組,建立肥胖癥動(dòng)物模型。每周稱量動(dòng)物體重一次。模型組動(dòng)物體重比對(duì)照組增加30%以上視為肥胖癥模型造模成功。 造模成功后,經(jīng)深度麻醉對(duì)動(dòng)物進(jìn)行眼球取血,離心獲取血清,檢測(cè)血清中總膽固醇(cholesterol, CHOL)、甘油三酯(triglycerides, TG)、血糖(glucose, GLU)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST)的含量。取動(dòng)物內(nèi)臟脂肪組織(腎周脂肪組織)進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取和Western Blot檢測(cè),分析Tshr在不同肥胖體征動(dòng)物中的表達(dá)變化。 2、臨床不同肥胖體征患者脂肪組織中Tshr的表達(dá)水平檢測(cè)： 臨床樣本來(lái)自在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院、經(jīng)病理學(xué)或相關(guān)影像學(xué)檢查為良性病變的患者。經(jīng)患者術(shù)前知情同意并經(jīng)山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)同意后,收集手術(shù)過(guò)程中在手術(shù)視野內(nèi)的贅余脂肪組織。按照個(gè)體體重指數(shù)(body mass index, BMI)大小將上述患者分為四組：偏^俗，

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