【摘要】：目的：應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌散在重復(fù)單位(MIRU)分型技術(shù)和鑒定北京基因型的方法來研究甘肅臨夏回族自治州結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學(xué)特征,尋找優(yōu)勢菌株,并評估該方法在結(jié)核病分子流行病學(xué)方面的應(yīng)用價值。 方法：甘肅省疾病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)監(jiān)測并收集甘肅省臨夏回族自治州2004-2006兩年間結(jié)核分枝桿菌和相關(guān)病例資料,共收集菌株318株。對其中培養(yǎng)成功并且鑒定為結(jié)核分枝桿菌(分別采用對硝基苯甲酸生長試驗和噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基試驗,PNB和TCH)的218株(69%)菌株進(jìn)行基因分型。采用絕對濃度法,將218個痰涂片陽性的標(biāo)本在羅氏(L-J)培養(yǎng)基上進(jìn)行抗結(jié)核藥物敏感性實驗。 采用氯仿、異戊醇手工提取分枝桿菌DNA,12個MIRU位點的等位基因位置、重復(fù)序列大小以及擴(kuò)增引物的設(shè)計合成,參考有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行。使用凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析,12個MIRU位點的拷貝數(shù)按順序組成一個12位數(shù)字,稱為該標(biāo)本的MIRU基因型,根據(jù)基因型是否相同,判斷菌株是成簇還是獨特型；采用UPGMA法對結(jié)核分枝桿菌基因型數(shù)字化的結(jié)果進(jìn)行聚類分析；用Microsoft Excel軟件處理和分析數(shù)據(jù),計算12個MIRU等位基因的多態(tài)性和MIRU等位基因的分辨率指數(shù)(HGDI);結(jié)合流行病學(xué)資料,分析菌株的流行和傳播特征。 鑒定北京株是通過對RD105缺失區(qū)的檢測,使用P1,P2、P3引物參考有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行設(shè)計合成。使用D2000 Marker作分子量標(biāo)志,同時以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和無菌蒸餾水以相同引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別作陽性和陰性對照。使用凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析,目的條帶在761bp處為北京株,目的條帶在1600bp處為非北京株。 結(jié)果：218株結(jié)核分枝桿菌分離自不同的病人,其中男性144人(66%),女性74人(34%),平均年齡45.4歲(范圍14-79歲)。有54(24.77%)株菌株至少對一種藥物耐藥,其中31(14.22%)株菌株是耐多藥菌株,至少對利福平和異煙肼同時耐藥,剩余菌株是敏感菌株。 218株結(jié)核分枝桿菌共分為115種不同的MIRU基因型,包括98種獨特型和17個簇集群包含120株(55.05%)成簇菌株,成簇率為47.25%,簇的范圍為2-58,最大簇的基因型為223325173533,包含58株菌株；通過對缺失區(qū)RD105的檢測,188株(86.23%)為北京基因型,30株(13.77%)為非北京基因型；結(jié)合MIRU基因分型和北京基因型分型兩種分型方法共分為118種不同基因型,包括101種獨特性和17個簇集群包含117株(54.13%)。MIRU基因分型中58株最大簇集群中50株菌株為北京基因型,8株為非北京基因型。12個MIRU位點在218株菌株中、在北京株和非北京株中的多態(tài)性有較大差別；MIRU等位基因的分辨率指數(shù)數(shù)(HGDI)為0.93,MIRU基因分型和北京基因型分型兩種方法結(jié)合分型分辨率指數(shù)為0.94. 結(jié)論：北京基因型的鑒別在流行病學(xué)分析中比較重要,將MIRU基因分型和北京基因型鑒定方法結(jié)合,發(fā)現(xiàn)甘肅臨夏州的主要流行菌株是MIRU基因型為223325173533的菌株,且主要流行菌株中大部分為北京家族菌株。此兩種分型方法結(jié)合分型是簡單、快速、有效、低成本的分型方法,比較適合用于我國結(jié)核分枝桿菌基因分型。 目的：從就診于甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院的痰標(biāo)本中篩查結(jié)核分枝桿菌利福平依賴菌株,初步研究利福平依賴菌株表型和基因型的變異,研究其致病機(jī)制,為依賴?yán)Ｆ骄暌鸬慕Y(jié)核病的診斷和防治提供新思路。 方法：將甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院檢驗科篩查的6例結(jié)核分枝桿菌利福平依賴株,接種于含與不含利福平的羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng),觀察培養(yǎng)基中菌落生長情況,采用萋爾-納爾遜(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法對羅氏培養(yǎng)基有菌落生長的標(biāo)本進(jìn)行涂片、染色、顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)；提取其中依賴現(xiàn)象明顯的4株菌株DNA, MIRU12位點PCR擴(kuò)增以及鑒定是否為北京家族菌株,進(jìn)行菌株基因分型,以及測定依賴現(xiàn)象最明顯菌株1034全基因組DNA、轉(zhuǎn)錄組RNA序列。 結(jié)果：6例結(jié)核分枝桿菌利福平依賴菌株中,4例利福平依賴現(xiàn)象明顯,羅氏培養(yǎng)結(jié)果觀察顯示羅氏培養(yǎng)基中利福平依賴菌株對利福平的依賴現(xiàn)象比較明顯,在不含有利福平的培養(yǎng)基中菌落細(xì)小、較少,在含有利福平的培養(yǎng)基中菌落粗大、多,菌株1034傳代培養(yǎng)16代后,依賴現(xiàn)象仍然明顯存在；但是抗酸染色結(jié)果顯示前幾代細(xì)菌在不含有利福平的培養(yǎng)基中的菌體細(xì)小,在含有利福平的培養(yǎng)基中菌體粗大,傳代培養(yǎng)至6-7代,在含有利福平和不含有利福平培養(yǎng)基中的細(xì)菌抗酸染色結(jié)果沒有區(qū)別,基本一致。通過MIRU基因分型,4株利福平依賴菌株中,其中3株基因型為223325173533,與我們之前尋找出的甘肅省優(yōu)勢菌株基因型一致,另外1株基因型為222325173533；通過DTM-PCR方法鑒定此4株依賴菌株均屬于北京家族菌株。我們已經(jīng)提取利福平依賴菌株1034 DNA及RNA(對照組、利福平高濃度組),送往華大基因公司做全基因組及轉(zhuǎn)錄組的測序,結(jié)果尚未報告。 結(jié)論：臨床結(jié)核分枝桿菌的利福平依賴現(xiàn)象存在,但不穩(wěn)定；利福平依賴現(xiàn)象可能是由于體內(nèi)外環(huán)境不同從而導(dǎo)致在體外培養(yǎng)過程表型的變異,出現(xiàn)依賴現(xiàn)象,也可能是基因的變異而致依賴現(xiàn)象的發(fā)生；及時監(jiān)測臨床利福平依賴菌株對結(jié)核病的治療有指導(dǎo)意義；通過對臨床利福平依賴菌株表型、基因變異的研究,了解依賴菌株的致病機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2425370