發(fā)布時間：2019-02-17 17:08

【摘要】：擴張型心肌病(Dilated Cardiomyopathy, DCM)是一類由原發(fā)性心肌病變導(dǎo)致的心肌疾病,臨床特征為左心室、右心室或雙側(cè)心室擴張,并伴有心肌肥厚、心室收縮功能障礙,伴或不伴充血性心力衰竭等。其病情呈進行性加重,死亡可發(fā)生于疾病的任何階段,它是導(dǎo)致心力衰竭的主要原因之一。DCM的發(fā)病機制目前尚不清楚,病毒感染、自身免疫、細(xì)胞凋亡、遺傳等因素可能與DCM的發(fā)病相關(guān)。部分DCM有明顯的家族聚集性,通過家系調(diào)查和超聲心動圖對DCM患者的親屬篩查證實,約25%-35%的DCM為家族性擴張型心肌病(familial dilated cardiomyopathy, FDCM)。已經(jīng)觀察到FDCM有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X-連鎖遺傳、母系遺傳等遺傳方式。FDCM為DCM遺傳基礎(chǔ)及致病機理的研究提供了獨特的資源。但是,由于很難獲得病變組織標(biāo)本,無法開展相關(guān)致病機理研究,這在很大程度上制約了DCM發(fā)病機制的研究。 2006年日本科學(xué)家Shinya Yamanaka首先報道通過外源表達(dá)Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc四個因子可以將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(iPSCs),2007年Yamanaka實驗室和Thomson實驗室獨立報道了在人類細(xì)胞中誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞獲得成功。iPSCs在形態(tài)、全基因組表達(dá)譜、表觀遺傳學(xué)以及分化潛能等方面與胚胎干細(xì)胞(ESCs)十分相似。iPSCs取材方便,并且具有與ESCs相同的分化潛能,能夠分化成有功能的心肌細(xì)胞,可為DCM的病理機制研究帶來新的策略。 本實驗室前期研究工作中收集到一個伴發(fā)有傳導(dǎo)功能障礙的擴張型心肌病家系,呈常染色體顯性遺傳。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TNIKc.153AG的雜合突變在家系中與疾病共分離,為了在心肌細(xì)胞中研究該突變的致病機理,我們通過皮膚組織活檢獲得了患者的皮膚組織,經(jīng)原代培養(yǎng)得到皮膚成纖維細(xì)胞(HDF),同時用293T細(xì)胞包裝含Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc四個因子的假病毒,通過病毒高效的將Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc導(dǎo)入HDF中表達(dá),同時改變培養(yǎng)條件、加入提高誘導(dǎo)效率的小分子化合物維生素C和丙戊酸,進行iPSCs的誘導(dǎo),獲得了ESCs樣的克隆。我們挑取的克隆能夠用ESCs培養(yǎng)條件擴增,始終保持ESCs樣的形態(tài)特征,通過AP染色、核型鑒定、突變驗證、免疫熒光檢測、多潛能性相關(guān)基因表達(dá)分析和體內(nèi)體外分化能力檢測確定了我們獲得的細(xì)胞為來自HDF的完全重編程的iPSCs,建立了該FDCM的誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞模型。同時用ESCs摸索多能干細(xì)胞向心肌分化的方法,以建立高效的iPSCs向心肌分化的方法,但是我們的心肌分化只在ESCs中取得了成功,后續(xù)研究工作將致力于iPSCs向心肌細(xì)胞的分化。
[Abstract]:Dilated cardiomyopathy (Dilated Cardiomyopathy, DCM) is a kind of myocardial disease caused by primary cardiomyopathy. It is characterized by dilatation of left ventricle, right ventricle or bilateral ventricle, accompanied by hypertrophy of myocardium and dysfunction of ventricular systolic function. With or without congestive heart failure, etc. Its condition is progressive aggravation, death can occur at any stage of the disease, it is one of the main causes of heart failure. The pathogenesis of DCM is not clear, virus infection, autoimmune, apoptosis, Genetic factors may be associated with the pathogenesis of DCM. Some DCM had obvious familial aggregation. Family investigation and echocardiographic screening of relatives of DCM patients confirmed that about 25-35% of DCM was familial dilated cardiomyopathy (familial dilated cardiomyopathy, FDCM). Autosomal dominant inheritance, autosomal recessive inheritance, X-linkage inheritance and maternal inheritance have been observed in FDCM. FDCM provides a unique resource for the study of genetic basis and pathogenesis of DCM. However, because it is difficult to obtain pathological tissue samples, it is impossible to study the pathogenesis of DCM, which restricts the study of pathogenesis of DCM to a great extent. In 2006, Japanese scientist Shinya Yamanaka first reported that the expression of four factors, Oct4,Sox2,Klf4 and c-Myc, could transform mouse embryonic fibroblasts (MEF) into induced multipotent stem cells (iPSCs),). In 2007, Yamanaka Labs and Thomson Labs independently reported the success of inducing pluripotent stem cells in human cells. Epigenetics and differentiation potential are very similar to embryonic stem cells (ESCs). IPSCs has the same differentiation potential as ESCs and can differentiate into functional cardiomyocytes. It can bring new strategies for the study of pathological mechanism of DCM. An autosomal dominant inheritance of dilated cardiomyopathy (DCM) with conduction dysfunction was collected in our laboratory. Genetic studies have found that the heterozygous mutation of TNIKc.153AG is isolated from the disease at home. In order to study the pathogenesis of the mutation in cardiomyocytes, we obtained the skin tissue of the patient by skin biopsy. Skin fibroblasts (HDF),) were obtained by primary culture, and 293T cells were used to package pseudoviruses containing Oct4,Sox2,Klf4 and c-Myc. Oct4,Sox2,Klf4 and c-Myc were highly expressed in HDF. At the same time, the iPSCs was induced by adding vitamin C and valproic acid, which could improve the induction efficiency. The ESCs like clones were obtained. The clones we selected can be amplified by ESCs culture conditions, always maintaining the morphological characteristics of ESCs, by AP staining, karyotype identification, mutation verification, immunofluorescence detection, The multipotential gene expression analysis and in vitro differentiation test confirmed that the cells we obtained established the FDCM induced multipotential stem cell model for the fully reprogrammed iPSCs, from HDF. At the same time, ESCs was used to explore the method of multipotent stem cell differentiation into myocardium, so as to establish an efficient method for the differentiation of iPSCs into myocardium. However, our myocardial differentiation was only successful in ESCs. The subsequent research will focus on the differentiation of iPSCs into cardiomyocytes.
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R542.2;R-332

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本文編號：2425393