【摘要】：目的探討轉(zhuǎn)染外源性抗增殖蛋白(prohibitin, PHB)基因在缺氧性腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cell, RTEC)損傷中的作用及機制,為臨床防治腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis, RIF)提供新思路。 方法構(gòu)建pcDNA3.1(+)-PHB1貢粒、pcDNA3.1(+)-PHB2質(zhì)粒及pcDNA3.1(+)-eGFP質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞系(NRK-52E),采用表達綠色熒光的陰性對照pcDNA3.1(+)-eGFP在倒置熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48h后隨機分為2組：正常組和模型組,正常組NRK-52E細胞置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),模型組NRK-52E細胞置于真空干燥罐中,負壓吸引器抽盡殘余空氣,充以含體積分數(shù)為95%N2+5%C02的缺氧氣體,密封的方法建立缺氧性RTEC損傷模型。模型組和正常組各設(shè)立5個亞組：空白對照組、陰性質(zhì)粒對照組、脂質(zhì)體對照組、轉(zhuǎn)染PHB1組及轉(zhuǎn)染PHB2組。造模12h復氧1h后掃描電鏡觀察NRK-52E細胞形態(tài),實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)法檢測NRK-52E細胞PHB1、PHB2及α-平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscel actin, α-SMA) mRNA表達,免疫印跡(Western blot)法檢測NRK-52E細胞PHB1、PHB2及a-SMA蛋白表達,流式細胞儀檢測NRK-52E細胞線粒體膜電位,比色法檢測NRK-52E細胞培養(yǎng)上清液丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。 結(jié)果1.成功復蘇NRK-52E細胞后按3×105的個數(shù)接種到6孔細胞培養(yǎng)板,24h后轉(zhuǎn)染時細胞可達到80-90%的匯合度。按照脂質(zhì)體Lipofectamine2000說明書推薦的比例轉(zhuǎn)染NRK-52E細胞,轉(zhuǎn)染效率約為80%。 2.(1)正常組和模型組中轉(zhuǎn)染PHB1組、轉(zhuǎn)染PHB2組的NRK-52E細胞PHB1、PHB2的mRNA和蛋白表達量均顯著高于相應(yīng)各組中空白對照組、陰性對照組、脂質(zhì)體對照組(P0.05),而空白對照組、陰性對照組、脂質(zhì)體對照組之間無顯著性差異(P0.05)；(2)正常組和模型組中轉(zhuǎn)染PHB1組、轉(zhuǎn)染PHB2組的NRK-52E細胞α-SMA mRNA和蛋白表達量均顯著低于相應(yīng)各組中空白對照組、陰性對照組、脂質(zhì)體對照組(P0.05),而空白對照組、陰性對照組、脂質(zhì)體對照組之間無顯著性差異(P0.05)；(3)與正常組各亞組比較,模型組中相應(yīng)各亞組NRK-52E細胞PHB1、PHB2mRNA和蛋白表達量均顯著降低(P0.05),而α-SMA mRNA表達量均顯著增高(P0.05) 3.(1)正常組和模型組中的轉(zhuǎn)染PHB1組、轉(zhuǎn)染PHB2組NRK-52E細胞的線粒體膜電位均顯著高于相應(yīng)各組中空白對照組、陰性對照組、脂質(zhì)體對照組(P0.05),而空白對照組、陰性對照組、脂質(zhì)體對照組之間無顯著性差異(P0.05)；(2)與正常組各亞組比較,模型組中相應(yīng)各亞組NRK-52E細胞線粒體膜電位均顯著降低(P0.05)。 4.(1)正常組和模型組中轉(zhuǎn)染PHB1組、轉(zhuǎn)染PHB2組NRK-52E細胞的MDA含量均顯著低于相應(yīng)各組中空白對照組、陰性對照組、脂質(zhì)體對照組(P0.05),而空白對照組、陰性對照組、脂質(zhì)體對照組之間無顯著性差異(P0.05)；(2)與正常組各亞組比較,模型組中相應(yīng)各亞組NRK-52E細胞MDA含量均顯著升高(P0.05)。 結(jié)論轉(zhuǎn)染外源性PHB1和PHB2基因表達上調(diào)后,可能通過增加RTEC線粒體膜電位穩(wěn)定性、降低MDA的產(chǎn)生及α-SMA的表達量,而起到減輕缺氧性RTEC損傷的作用。
[Abstract]:Objective To study the role and mechanism of exogenous anti-proliferative protein (PHB) gene in the injury of renal tubular epithelial cell (RTEC), and to provide a new thought for clinical prevention and treatment of renal interstitial fibrosis (RIF). Methods The pcDNA3. 1 (+)-PHB1 tribute, the pcDNA3.1 (+)-PH2 plasmid and the pcDNA3.1 (+)-eGFP plasmid were constructed, and the tubular epithelial cell line (NRK-52E) was cultured in vitro by lipofectamine 2000. The negative control pcDNA3.1 (+)-eGFP expressing the green fluorescence was used to detect the transfection efficiency under the inverted fluorescence microscope. Rate. After transfection for 48 h, the cells were randomly divided into 2 groups: normal group and model group, normal group NRK-52E cells were placed in the incubator to continue to be cultured, the NRK-52E cells in the model group were placed in the vacuum drying tank, the negative pressure suction device was used to draw the residual air, and the oxygen-deficient gas with the volume fraction of 95% N2 + 5% C02 was filled. Method for establishing oxygen-deficient RTEC damage model by body and sealing method The model group and the normal group were divided into 5 subgroups: the blank control group, the negative plasmid control group, the liposome control group, the transfection of the PHB1 group and the transfection of the PHB2. The expression of NRK-52E cells, PHB1, PHB2 and human-smooth muscle actin (a-smooth muscel actin, antigen-SMA) mRNA and immunoblotting (Western blot) were used to detect the PHB-52E cells PHB-52E. 1. The expression of PH2 and a-SMA protein, the mitochondrial membrane potential of NRK-52E cells was detected by flow cytometry, and the content of malondialdehyde (MDA) in the cell culture of NRK-52E was detected by colorimetric method. Quantity. Results 1. After successful resuscitation of NRK-52E cells, the cells were inoculated into 6-hole cell culture plates by the number of 3-105, and the cells can reach 80-90% after 24-hour transfection. Confluence. The NRK-52E cells were transfected with the ratio recommended in the Lipofectamine2000 specification and the transfection efficiency was approximately 80 The expression of PHB1 and PHB2 of NRK-52E cells in the PHB2 group was significantly higher than that in the control group, the negative control group and the liposome control group (P0.05). In the negative control group, there was no significant difference between the control group and the control group (P0.05); (2) in the normal group and the model group, the PHB1 group was transfected, and the amount of the NRK-52E cells transfected with the PHB2 group was significantly lower than that in the blank control group, the negative control group and the liposome control group (P There was no significant difference between the control group, the negative control group and the liposome control group (P0.05). (3) There was no significant difference in the expression of PHB1, PHB2mRNA and protein in the corresponding subgroups in the model group (P <0.05). 0. 05), and the amount of SMA-SMA mRNA was significantly higher (P <0.05). P0. 05) 3. (1) The mitochondrial membrane potential of NRK-52E cells in the normal and model groups was significantly higher than that in the control group, the negative control group and the liposome control group (P0.05). There was no significant difference between the group, the negative control group and the liposome control group (P0.05). (2) The mitochondrial membrane potential of the corresponding sub-group NRK-52E in the model group was significantly reduced in the model group compared with each subgroup in the normal group. (P (0. 05). 4. (1) The content of MDA in the normal group and the model group was significantly lower than that of the control group, the negative control group and the liposome control group (P0.05) in the control group, the negative control group and the liposome control group. (2) The MDA content of NRK-52E cells in the corresponding subgroups was significant in the model group compared with each subgroup in the normal group. Conclusion The increase of the expression of exogenous PHB1 and PHB2 gene can decrease the stability of the mitochondrial membrane potential of the RTEC, decrease the production of MDA and the expression of the antigen-SMA, and play a role in reducing the deficiency.
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：2388660