【摘要】：目的探討轉(zhuǎn)染外源性抗增殖蛋白(prohibitin, PHB)基因在缺氧性腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cell, RTEC)損傷中的作用及機(jī)制,為臨床防治腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis, RIF)提供新思路。 方法構(gòu)建pcDNA3.1(+)-PHB1貢粒、pcDNA3.1(+)-PHB2質(zhì)粒及pcDNA3.1(+)-eGFP質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞系(NRK-52E),采用表達(dá)綠色熒光的陰性對(duì)照pcDNA3.1(+)-eGFP在倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48h后隨機(jī)分為2組：正常組和模型組,正常組NRK-52E細(xì)胞置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),模型組NRK-52E細(xì)胞置于真空干燥罐中,負(fù)壓吸引器抽盡殘余空氣,充以含體積分?jǐn)?shù)為95%N2+5%C02的缺氧氣體,密封的方法建立缺氧性RTEC損傷模型。模型組和正常組各設(shè)立5個(gè)亞組：空白對(duì)照組、陰性質(zhì)粒對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組、轉(zhuǎn)染PHB1組及轉(zhuǎn)染PHB2組。造模12h復(fù)氧1h后掃描電鏡觀察NRK-52E細(xì)胞形態(tài),實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞PHB1、PHB2及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smooth muscel actin, α-SMA) mRNA表達(dá),免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞PHB1、PHB2及a-SMA蛋白表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞線粒體膜電位,比色法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)上清液丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。 結(jié)果1.成功復(fù)蘇NRK-52E細(xì)胞后按3×105的個(gè)數(shù)接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,24h后轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞可達(dá)到80-90%的匯合度。按照脂質(zhì)體Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)推薦的比例轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率約為80%。 2.(1)正常組和模型組中轉(zhuǎn)染PHB1組、轉(zhuǎn)染PHB2組的NRK-52E細(xì)胞PHB1、PHB2的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著高于相應(yīng)各組中空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組(P0.05),而空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P0.05)；(2)正常組和模型組中轉(zhuǎn)染PHB1組、轉(zhuǎn)染PHB2組的NRK-52E細(xì)胞α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著低于相應(yīng)各組中空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組(P0.05),而空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P0.05)；(3)與正常組各亞組比較,模型組中相應(yīng)各亞組NRK-52E細(xì)胞PHB1、PHB2mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著降低(P0.05),而α-SMA mRNA表達(dá)量均顯著增高(P0.05) 3.(1)正常組和模型組中的轉(zhuǎn)染PHB1組、轉(zhuǎn)染PHB2組NRK-52E細(xì)胞的線粒體膜電位均顯著高于相應(yīng)各組中空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組(P0.05),而空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P0.05)；(2)與正常組各亞組比較,模型組中相應(yīng)各亞組NRK-52E細(xì)胞線粒體膜電位均顯著降低(P0.05)。 4.(1)正常組和模型組中轉(zhuǎn)染PHB1組、轉(zhuǎn)染PHB2組NRK-52E細(xì)胞的MDA含量均顯著低于相應(yīng)各組中空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組(P0.05),而空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P0.05)；(2)與正常組各亞組比較,模型組中相應(yīng)各亞組NRK-52E細(xì)胞MDA含量均顯著升高(P0.05)。 結(jié)論轉(zhuǎn)染外源性PHB1和PHB2基因表達(dá)上調(diào)后,可能通過(guò)增加RTEC線粒體膜電位穩(wěn)定性、降低MDA的產(chǎn)生及α-SMA的表達(dá)量,而起到減輕缺氧性RTEC損傷的作用。
[Abstract]:Objective To study the role and mechanism of exogenous anti-proliferative protein (PHB) gene in the injury of renal tubular epithelial cell (RTEC), and to provide a new thought for clinical prevention and treatment of renal interstitial fibrosis (RIF). Methods The pcDNA3. 1 (+)-PHB1 tribute, the pcDNA3.1 (+)-PH2 plasmid and the pcDNA3.1 (+)-eGFP plasmid were constructed, and the tubular epithelial cell line (NRK-52E) was cultured in vitro by lipofectamine 2000. The negative control pcDNA3.1 (+)-eGFP expressing the green fluorescence was used to detect the transfection efficiency under the inverted fluorescence microscope. Rate. After transfection for 48 h, the cells were randomly divided into 2 groups: normal group and model group, normal group NRK-52E cells were placed in the incubator to continue to be cultured, the NRK-52E cells in the model group were placed in the vacuum drying tank, the negative pressure suction device was used to draw the residual air, and the oxygen-deficient gas with the volume fraction of 95% N2 + 5% C02 was filled. Method for establishing oxygen-deficient RTEC damage model by body and sealing method The model group and the normal group were divided into 5 subgroups: the blank control group, the negative plasmid control group, the liposome control group, the transfection of the PHB1 group and the transfection of the PHB2. The expression of NRK-52E cells, PHB1, PHB2 and human-smooth muscle actin (a-smooth muscel actin, antigen-SMA) mRNA and immunoblotting (Western blot) were used to detect the PHB-52E cells PHB-52E. 1. The expression of PH2 and a-SMA protein, the mitochondrial membrane potential of NRK-52E cells was detected by flow cytometry, and the content of malondialdehyde (MDA) in the cell culture of NRK-52E was detected by colorimetric method. Quantity. Results 1. After successful resuscitation of NRK-52E cells, the cells were inoculated into 6-hole cell culture plates by the number of 3-105, and the cells can reach 80-90% after 24-hour transfection. Confluence. The NRK-52E cells were transfected with the ratio recommended in the Lipofectamine2000 specification and the transfection efficiency was approximately 80 The expression of PHB1 and PHB2 of NRK-52E cells in the PHB2 group was significantly higher than that in the control group, the negative control group and the liposome control group (P0.05). In the negative control group, there was no significant difference between the control group and the control group (P0.05); (2) in the normal group and the model group, the PHB1 group was transfected, and the amount of the NRK-52E cells transfected with the PHB2 group was significantly lower than that in the blank control group, the negative control group and the liposome control group (P There was no significant difference between the control group, the negative control group and the liposome control group (P0.05). (3) There was no significant difference in the expression of PHB1, PHB2mRNA and protein in the corresponding subgroups in the model group (P <0.05). 0. 05), and the amount of SMA-SMA mRNA was significantly higher (P <0.05). P0. 05) 3. (1) The mitochondrial membrane potential of NRK-52E cells in the normal and model groups was significantly higher than that in the control group, the negative control group and the liposome control group (P0.05). There was no significant difference between the group, the negative control group and the liposome control group (P0.05). (2) The mitochondrial membrane potential of the corresponding sub-group NRK-52E in the model group was significantly reduced in the model group compared with each subgroup in the normal group. (P (0. 05). 4. (1) The content of MDA in the normal group and the model group was significantly lower than that of the control group, the negative control group and the liposome control group (P0.05) in the control group, the negative control group and the liposome control group. (2) The MDA content of NRK-52E cells in the corresponding subgroups was significant in the model group compared with each subgroup in the normal group. Conclusion The increase of the expression of exogenous PHB1 and PHB2 gene can decrease the stability of the mitochondrial membrane potential of the RTEC, decrease the production of MDA and the expression of the antigen-SMA, and play a role in reducing the deficiency.
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 林月霞;吳志堅(jiān);袁茵;董斌;田素娟;;人乙酰肝素酶基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào);2011年04期

2 曾思聰;周兟;盧光t;;端粒酶shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染人類(lèi)胚胎干細(xì)胞[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年08期

3 李棟;聶代邦;王海軍;段新平;逄大欣;歐陽(yáng)紅生;;Fat-1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞脂肪酸含量的影響[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年11期

4 周建民;丁國(guó)富;王勤章;劉新軍;劉永國(guó);;應(yīng)用AdMax載體系統(tǒng)構(gòu)建SCL基因重組腺病毒表達(dá)載體[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2011年17期

5 史冊(cè);孫宏晨;李琛;陳彥澤;;腺病毒介導(dǎo)TWEAK基因?qū)ζ乒羌?xì)胞影響的體外研究[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2011年04期

6 周斌;傅豐慶;徐俊馳;沈宇;高菲;張學(xué)光;;人TLT-2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在L929細(xì)胞株中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染[J];蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年03期

7 沈培;鄭東;劉艷;田潔;趙銀霞;劉青玲;朱晨露;馬潔;蘇兆亮;馬斌;許化溪;王勝軍;;小鼠GITR真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J];江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年04期

8 朱春暉;謝勇;呂農(nóng)華;;外源性野生型p53基因?qū)w1990細(xì)胞調(diào)控基因表達(dá)的影響[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年04期

9 顧立學(xué);羅俊生;王瑞;馮旭;關(guān)寧;霍曉川;;人膽固醇酯水解酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建及U937細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染[J];山東醫(yī)藥;2011年26期

10 王海紅;董為人;張琳;晏芳;劉忠英;李妍;;真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-tau的構(gòu)建及在HEK293細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年28期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 傅新巧;張?zhí)K明;褚倩;肖文伍;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染人TH基因的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

2 王錫山;趙旭海;王軼慧;姜世雄;;肽核酸(PNA)對(duì)大腸癌LS-174T細(xì)胞生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)研究[A];第四屆中國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)暨第五屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

3 李建軍;陳延治;李光;顧菲;王志宇;辛彥;;外源性PTEN增強(qiáng)放射線誘導(dǎo)胰腺癌ASPC-1細(xì)胞G_2／M期阻滯[A];第四屆中國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)暨第五屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

4 劉顏顏;武軍駐;何春燕;李小明;;人a-保護(hù)素1在細(xì)胞氧化低密度脂蛋白中的作用[A];湖北省暨武漢市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)第八屆第十七次學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2007年

5 葉芳;張嵐;楊濤;喬振華;楊林花;;人全長(zhǎng)Survivin表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞[A];第12屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2009年

6 祁麗;邢麗娜;馬景光;;轉(zhuǎn)染VEGF-C反義寡核苷酸對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和調(diào)亡的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)放射腫瘤治療學(xué)分會(huì)六屆二次暨中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤放療專(zhuān)業(yè)委員會(huì)二屆二次學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

7 車(chē)興華;陳洪;徐振明;尚超;孫開(kāi)來(lái);富偉能;;14-3-3epsilon通過(guò)影響癌細(xì)胞凋亡及侵襲能力在喉癌中發(fā)揮抑癌作用[A];北方遺傳資源的保護(hù)與利用研討會(huì)論文匯編[C];2010年

8 張書(shū)霞;步志高;陳萬(wàn)芳;;雞bcl—2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡的影響[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)病理學(xué)分會(huì)第十一次獸醫(yī)病理學(xué)、第十次動(dòng)物病理生理學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2001年

9 劉旭;李殿俊;田長(zhǎng)富;李天天;;腺病毒介導(dǎo)的hIL-2基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性研究[A];第七屆全國(guó)腫瘤生物治療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2001年

10 鄭義;史斌;崔建英;;逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)多藥抗性基因轉(zhuǎn)染臍帶血CD34+細(xì)胞[A];第三屆全國(guó)血液免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2003年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 馮世容;CD95基因轉(zhuǎn)染可提高胰腺癌對(duì)化療藥物敏感性[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2001年

2 白毅;上海創(chuàng)建大規(guī)模細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)平臺(tái)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

3 張中橋;NDRG2可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

4 吳一福;PTFE血管材料可攜載VEGF基因轉(zhuǎn)染[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

5 張中橋;反義Cortactin基因能抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

6 高國(guó)起;膀胱癌基因治療新技術(shù)[N];科技日?qǐng)?bào);2003年

7 吳一福;四醫(yī)大建成出血熱B淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

8 吳一福;川大成功建立人新基因PCIA1細(xì)胞株[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

9 吳軍　楊太成;主動(dòng)特異性免疫療法治療腫瘤[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

10 張中橋;第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性RNA干擾[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王芳;整合素連接激酶在胎盤(pán)血管性疾病中的作用研究[D];華中科技大學(xué);2012年

2 楊萍;丹參酮ⅡA及Prohibitin蛋白在缺血—再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

3 徐徠;胰腺癌候選免疫原性膜抗原-Prohibitin生物學(xué)功能研究及預(yù)后分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

4 紀(jì)敏;MCL1、AF1q和microRNA在白血病中的作用及其機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2011年

5 劉棟良;基因載體陽(yáng)離子類(lèi)脂設(shè)計(jì)合成及生物性能研究[D];大連理工大學(xué);2006年

6 羅文娟;人血小板源性生長(zhǎng)因子基因B轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)[D];青島大學(xué);2005年

7 任曉勇;人生長(zhǎng)分化因子-5基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及用于軟骨缺損修復(fù)的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

8 趙福杰;轉(zhuǎn)染反義c-erbB-2 mRNA對(duì)子宮內(nèi)膜癌ISHIKAWA及HEC-1A細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制作用的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2006年

9 李輝南;rhIGF-1對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松治療作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2006年

10 梁顯軍;p16基因轉(zhuǎn)染對(duì)大腸癌細(xì)胞周期及放射敏感性的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 邵明斌;轉(zhuǎn)染外源性prohibitin在缺氧性腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2012年

2 陳娟;外源蛋白在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊中的瞬時(shí)表達(dá)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

3 張宏濤;NF-κB誘捕物寡聚核苷酸對(duì)大鼠移植腎早期炎性損傷的影響[D];鄭州大學(xué);2005年

4 何小寧;人溶菌酶基因乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其在小鼠乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2006年

5 劉萍;口蹄疫病毒3C基因的真核表達(dá)及其誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

6 黃旋平;hBMP-2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2007年

7 劉春江;大鼠胎腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及電穿孔轉(zhuǎn)染[D];中南大學(xué);2009年

8 蕭平難;穩(wěn)定過(guò)表達(dá)BAALC基因的人白血病細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)活性研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

9 李t$;肺癌細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC體外誘導(dǎo)肺癌患者抗瘤免疫的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2002年

10 陳幸德;豬干擾素-γ基因的克隆及其表達(dá)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

，

本文編號(hào)：2388660