【摘要】：目的：研究慢病毒介導(dǎo)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(h-TERT)基因?qū)θ藦埵细渭?xì)胞(chang liver)生物學(xué)特性的影響。 方法：將表達(dá)h-TERT基因的重組慢病毒感染人肝細(xì)胞,通過殺稻瘟篩選獲得陽性克隆。采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后chang liver肝細(xì)胞的h-TERT-mRNA基因表達(dá)水平和運(yùn)用TRAP-PCR法擴(kuò)增端粒重復(fù)序列以及ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后chang liver肝細(xì)胞的端粒酶活性的變化。通過倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察轉(zhuǎn)染前后肝細(xì)胞形態(tài)變化及生長增殖情況。通過MTT法觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增長變化,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞周期。通過全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALB含量以及用RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALB mRNA的表達(dá)。采用過碘酸希夫(periodic acid schiff, PAS)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞糖原染色。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染后的chang liver肝細(xì)胞存在h-TERT基因過表達(dá)和端粒酶活性上調(diào)。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)h-TERT-chang liver均呈橢圓形、紡錘形或多角形,上皮樣細(xì)胞貼壁生長,與轉(zhuǎn)染前細(xì)胞相比無明顯差異。細(xì)胞生長曲線發(fā)現(xiàn)h-TERT-chang liver較chang liver生長速度明顯提高,進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞周期觀察到其G1期細(xì)胞數(shù)下降,G2/M期和S期的細(xì)胞數(shù)升高,P I升高,提示h-TERT-chang liver較chang liver增殖能力較強(qiáng)。培養(yǎng)上清生化指標(biāo)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后的肝細(xì)胞仍然保持了轉(zhuǎn)染前肝細(xì)胞的合成分泌ALB功能,轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞PAS染色結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染后的肝細(xì)胞仍然保持轉(zhuǎn)染前肝細(xì)胞的糖原合成功能。 結(jié)論：利用h-TERT基因構(gòu)建的h-TERT-chang liver肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下基本維持肝細(xì)胞原有形態(tài),存活期顯著延長,增殖能力較強(qiáng)；并且具有表達(dá)和分泌ALB及合成糖原的功能；為生物人工肝在臨床的廣泛應(yīng)用提供了廉價(jià)易得且安全可靠的肝細(xì)胞源,為肝細(xì)胞移植和體外藥物篩選建立了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和生物學(xué)模型。
[Abstract]:Aim: to study the effect of human telomerase reverse transcriptase (h-TERT) gene mediated by lentivirus on the biological characteristics of human (chang liver) in Zhang's hepatocytes. Methods: the recombinant lentivirus expressing h-TERT gene was infected with human hepatocytes and positive clones were obtained by killing rice blast. The expression level of h-TERT-mRNA gene in chang liver hepatocytes before and after transfection was detected by real-time fluorescence RT-PCR, telomere repeat sequence was amplified by TRAP-PCR method, and telomerase activity of chang liver hepatocytes before and after transfection was detected by ELISA. The morphological changes and proliferation of hepatocytes before and after transfection were observed by inverted phase contrast microscope. Cell growth before and after transfection was observed by MTT, and cell cycle was detected by flow cytometry (FCM) before and after transfection. The content of ALB in supernatant of cell culture before and after transfection and the expression of ALB mRNA in supernatant of cell culture before and after transfection were detected by automatic biochemical analyzer and RT-PCR method. Cell glycogen staining was performed before and after transfection by (periodic acid schiff, PAS) assay. Results: overexpression of h-TERT gene and up-regulation of telomerase activity were observed in chang liver hepatocytes after transfection. Morphological observation showed that h-TERT-chang liver were oval-shaped, fusiform or polygonal, epithelioid cells were adherent to the wall, and there was no significant difference between the cells before transfection and those before transfection. The cell growth curve showed that the growth rate of h-TERT-chang liver was significantly higher than that of chang liver. Further cell cycle analysis showed that the number of cells in G1 phase decreased, and the number of cells in G 2 / M phase and S phase increased in G 2 / M phase and S phase. The results suggest that h-TERT-chang liver has stronger proliferative ability than chang liver. The biochemical index of culture supernatant showed that the hepatocytes still maintained the function of synthesis and secretion of ALB before and after transfection, and the PAS staining showed that before and after transfection. After transfection, the hepatocytes maintained the function of glycogen synthesis before transfection. Conclusion: the h-TERT-chang liver hepatocytes constructed by h-TERT gene have the function of expressing and secreting ALB and synthesizing glycogen. It provides a cheap, safe and reliable source of hepatocytes for the wide application of bioartificial liver in clinic, and establishes a new experimental basis and biological model for hepatocyte transplantation and drug screening in vitro.
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2385408