【摘要】：1997年出現人感染H5N1高致病性禽流感的首例病例[1],隨后新病例不斷增加,人們非常擔心禽流感疫情很可能會導致新的一次人流感大流行。疫苗和藥物在流感爆發(fā)的不同波段發(fā)揮作用,對防控流感有很好的效果。流感疫苗接種后7 10天就開始產生相對應疫苗的保護性抗體,接種后抗體持續(xù)時間可以達到一年左右,因此接種流感疫苗被認為是預防流感發(fā)生與傳播的最佳方法[2]。現在,大量的疫苗是根據流行株在雞胚中培養(yǎng)制備。然而,多年的實踐表明,這種生產方式很難做到流感疫苗充足和及時供應。更重要的是,雞胚培養(yǎng)技術不能應對大流感危機。因為H5N1禽流感病毒株常常致雞胚死亡[3],必須花費數個月的時間獲得能在雞胚中繁殖與新毒株匹配的毒株。另外,由于高致病性禽流感的致病性,傳統(tǒng)的禽流感疫苗生產工藝必須有生物安全三級設備的保障。因此,建立新的流感疫苗的技術方案是應對大流行的首要對策。 病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是由多個結構蛋白組成,能模擬天然病毒粒子的組成、構造,然而不含有病毒基因組物質。與單個蛋白或多肽相比,VLPs呈現出與天然病毒粒子更相似的抗原決定簇,因此,作為免疫原能引起顯著提高抗體應答和免疫系統(tǒng)反應。依賴表面大量重復性的抗原,VLPs在缺少佐劑的情況下,能通過與B細胞表面受體交聯誘導強烈的B細胞反應[4、5]。 昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)是一種能在昆蟲細胞中表達重組蛋白的有效工具,與其他系統(tǒng)相比存在很多的優(yōu)越性�；虮磉_在真核環(huán)境中進行,有利于蛋白的折疊和表達后修飾加工及裝配;可以獲得很高的蛋白表達量,并且操作安全;還可以通過共感染細胞同時表達兩個或多個蛋白;使得這個系統(tǒng)尤其適合多亞基蛋白的表達,如制備VLPs[6]。流感病毒的HA蛋白具有很強的抗原表位,可刺激機體產生保護性免疫應答;NA特異性抗體可抵抗病毒的感染、減少病毒復制、阻斷病毒傳播;M1蛋白是一種多功能因子;流感病毒的HA、NA、M1三個蛋白即可自我包裝成病毒樣顆粒。M2蛋白對流感病毒樣顆粒的包裝具有促進作用,而且目前普遍接受M2作為廣譜流感疫苗的抗原。本研究選擇共表達A/goose/Jilin/hb/2003(H5N1)病毒的HA、NA蛋白和A/PR/8/34(H1N1)流感病毒的M1和M2蛋白,包裝流感病毒樣顆粒,制備rH5N1流感疫苗。 首先,我們構建了含有切割位點多個氨基酸缺失突變的HA基因,并將其克隆到載體pFastBac Dual[7]的苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nuclearpolyhedrosis virus,AcMNPV )多角體蛋白啟動子(Polyhedrin promoter, PpH)下游的NotI和HindⅢ位點之間,NA蛋白克隆到AcMNPV的P10蛋白啟動子(P10 promoter,Pp10)下游的XhoI和SphI位點之間,命名為pFastDual-ΔHA-NA。同樣的,M2基因克隆到pFastBac Dual的AcMNPV的PpH和下游的NotI和HindⅢ位點之間,并將M1基因克隆到Pp10下游的XhoI和SphI位點之間,即pFastDual-M1-M2。 重組桿粒通過轉化轉移載體(pFastBac Dual-ΔHA-NA、pFastBac Dual-M1-M2)到大腸桿菌E. coli DH10Bac感受態(tài)細胞,通過特殊位點同源重組產生。這種菌株中包含預裝的AcMNPV基因組和能編碼Tn7轉座酶的輔助質粒[8]。通過藍白斑篩選和菌落PCR鑒定等方法篩選出含有重組桿粒的菌株,對最終篩選的陽性菌落提取重組桿狀病毒DNA,得到了桿粒rBacmid-ΔHA-NA、rBacmid -M1-M2。 將重組桿粒分別轉染sf9細胞,5天后收獲細胞培養(yǎng)上清,即獲得重組桿狀病毒(the recombinant baculoviruses rBVs),通過空斑試驗測定收獲的重組桿狀病毒的滴度,按病毒感染復數(MOI)值為0.1,富集高滴度的第二代(P2)病毒;繼續(xù)按MOI值為0.1,擴大細胞數量和體積,富集第三代病毒(P3),經富集后第三代病毒滴度達到1.0×108pfu/ml。用富集的重組桿狀病毒rBV-ΔHA-NA-P3和rBV-M1-M2-P3分別感染HighFive昆蟲細胞,通過Western-Blot分別檢測到HA、NA、M1、M2四種蛋白,證明四種蛋白可以在該系統(tǒng)中表達。 用兩種重組桿狀病毒共同感染無血清懸浮培養(yǎng)的HighFive昆蟲細胞,感染復數均為5,制備VLPs。感染3天后收獲感染上清,經濃縮后進行超速離心100,000×g,4h;離心沉淀重新懸浮后進行cellufine sulfate柱層析純化。透射電鏡觀察到制備的VLPs形態(tài)與流感病毒一致,直徑約80nm的球形,表面具有流感病毒的典型特征—穗花樣結構;Western-Blot結果顯示病毒樣顆粒中包括HA、NA、M1、M2四種蛋白組分;血凝試驗表明病毒樣顆粒具有凝集雞紅細胞的活性,血凝效價約為128HAU/μg。 最后,使用10μg的VLPs及佐劑采用腿部肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠,初免后21天同樣劑量加強免疫。免疫后所有的小鼠均表現健康,沒有不良反應。初次免疫和加強免疫之前(0,21天)及每周采集血清,分別以293細胞制備的H5N1HA蛋白和雞胚制備的H5N1病毒作為抗原,間接酶聯免疫法檢測血清HA特異性抗體和病毒特異性抗體,初免后VLPs誘導小鼠產生低的或檢測不到的抗體,加強免疫后1周特異性抗體效價持續(xù)升高,至加強免疫后4周HA特異性抗體效價達1:40,000,病毒特異性抗體達到1:200,000,血凝抑制滴度達到1:1600,空斑減少試驗檢測到中和抗體效價達到1:160,說明病毒樣顆粒具有較好的免疫原性。 本研究利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)共表達A/goose/Jilin/hb/2003(H5N1)病毒的HA、NA蛋白和A/PR/8/34(H1N1)流感病毒的M1和M2蛋白,包裝的流感病毒樣顆粒能誘導小鼠產生中和H5N1流感病毒的抗體,四種蛋白組成的流感病毒樣顆粒有作為疫苗的潛能。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【共引文獻】

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1 王立強;許龍;周曉巍;楊志新;陸健f;劉冰;夏炳輝;楊津;黃培堂;;應用HA、NA、M1和M2蛋白制備H5N1高致病性禽流感病毒樣顆粒[J];生物技術通訊;2011年06期

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1 楊慧婷;應用昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)制備口蹄疫病毒空衣殼及其免疫原性檢測[D];山東師范大學;2013年

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本文編號：2382129