【摘要】：第一部分大鼠骨髓間充質干細胞分離培養(yǎng)及低氧預處理模型的建立 目的：全骨髓細胞貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs),采用氯化鈷(CoCl2)建立化學低氧預處理BMSCs實驗模型。 方法：采用全骨髓細胞貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長過程,取第3-4代細胞用于實驗。體外標準誘導下檢測此類細胞成脂、成骨等多向分化能力,并以流式細胞儀檢測其表面標志物CD29、CD90、CD45。分別采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法和流式細胞儀,檢測不同CoCl2濃度(0、50、100、150、200、300、400、600μmol/L)和不同培養(yǎng)時間(0h、6h、12h、24h、48h、72h)培養(yǎng)條件下BMSCs的增殖和凋亡情況,確立CoC12化學低氧預處理BMSCs實驗模型。 結果：1.原代細胞呈梭形或不規(guī)則形,貼壁集落生長,貼壁細胞經(jīng)3次傳代后,細胞大小及形態(tài)趨于一致,呈長梭形、放射狀生長。2.在標準成脂誘導條件下,油紅染色證實其可向脂肪細胞分化；在標準成骨誘導條件下,茜素紅染色證實其可向成骨細胞分化：流式細胞儀檢測細胞表面抗原,結果顯示CD29和CD90高表達,CD45低表達,符合骨髓間充質干細胞免疫表型。3.細胞培養(yǎng)液中CoCl2終濃度不超過200μmol/L、培養(yǎng)時間不超過24h對BMSCs的增殖和凋亡無明顯影響。 結論：1.全骨髓細胞貼壁培養(yǎng)法可獲得較高純度的大鼠BMSCs,滿足體外實驗要求。2.本研究最佳低氧預處理BMSCs實驗模型為細胞培養(yǎng)液CoCl2終濃度200μmol/L、培養(yǎng)時間24h。 第二部分低氧預處理對大鼠骨髓間充質干細胞體外遷移能力的影響及其機制研究 目的：觀察低氧預處理對大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)體外遷移能力影響,并初步探討其機制。 方法：體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs,取第3-4代細胞用于實驗。分別運用siRNA技術沉默低氧誘導因子-1α(Hypoxia-indue ible factor-1, HIF-la)基因或使用趨化因子受體4(Chemokine receptor4, CXCR4)抑制劑AMD3100,將細胞分成4組：常氧培養(yǎng)組(N組)、低氧預處理組(H組)、低氧預處理+HIF-1αRNA干擾組(HR組)及低氧預處理+ADM3100干預組(HA組)。運用細胞劃痕實驗及Transwell細胞遷移實驗檢測低氧預處理對大鼠BMSCs體外遷移能力的影響。Western blot和Real-time PCR檢測低氧預處理BMSCs后HIF-1α和CXCR4蛋白及mRNA表達。 結果：1.細胞劃痕實驗及Transwell細胞遷移實驗發(fā)現(xiàn)低氧預處理組BMSCs細胞遷移能力較常氧培養(yǎng)組明顯增強[劃痕試驗：(0.396+0.018)mm比(0.200+0.011)mm, Transwell細胞遷移實驗：(21.0±4.5)比(8.5±1.7),P值均0.05]；低氧預處理組BMSCs經(jīng)HIF-1α基因沉默后或經(jīng)AMD3100處理后細胞遷移能力較低氧預處理組明顯降低(P0.05),但與常氧培養(yǎng)組相比無明顯差異(P0.05)。2.低氧預處理組HIF-1α及CXCR4蛋白及mRNA表達明顯高于常氧培養(yǎng)組(P0.05)；HIF-1α基因沉默BMSCs經(jīng)低氧預處理后其HIF-1α及CXCR4蛋白及nRNA表達明顯低于單純低氧預處理組(P0.05)。 結論：1.低氧預處理可使BMSCs的HIF-1α及CXCR4表達增加,抑制HIF-1α表達后CXCR4表達亦下降。2. CoCh誘導的化學低氧預處理可促進BMSCs的體外遷移能力,其機制可能與低氧預處理后HIF-1α表達上調進而介導CXCR4轉錄增加有關。 第三部分低氧預處理骨髓間充質干細胞頸動脈注射移植治療大鼠急性缺血性腎損傷的實驗研究 目的：探討低氧預處理(HP)后BMSCs對大鼠急性缺血性腎損傷的治療作用及其可能機制。 方法：夾閉雙側腎蒂40min建立大鼠缺血再灌注(Ischemia repeffusion, I/R)急性腎損傷模型。I/R大鼠分為3組：細胞培養(yǎng)基移植組(control組)、常氧培養(yǎng)BMSCs移植組(normoxia+BMSCs組)及HP處理BMSCs移植組(Co+BMSCs組)。移植時機為再灌注后即刻(1h內),移植方式為頸動脈注射。移植后24h、48h、72h及1周時處死大鼠,留取血清和腎組織,檢測血清尿素氮(BUN)和肌酐(SCr),并觀察腎臟病理變化。同時,以超順磁氧化鐵納米顆粒(SPION)體外標記大鼠BMSCs,在移植后2h、24h、48h及72h時應用3.0T臨床型磁共振儀T2*WI對標記細胞移植大鼠腎臟成像,利用腎臟皮質信號強度變化(ASI)對移植細胞進行活體示蹤,比較常氧培養(yǎng)BMSCs和HP處理后BMSCs移植后向腎臟歸巢的數(shù)量差異。 結果：1SPION終濃度為30μg/ml時標記率可達到97.5%±3.2%,普魯士藍鐵染色顯示藍色鐵顆粒位于細胞質內,且細胞生長和活力未受影響。2.再灌注后24h,normoxia+BMSCs組及Co+BMSCs組BUN、Scr水平均低于Control組(P值均0.05),且Co+BMSCs組低于riormoxia+BMSCs組(P0.05),再灌注后1周,Co+BMSCs組BUN、Scr水平仍低于normoxia+BMSCs組和control組(P值均0.05),而后兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；再灌注后24h,腎小管上皮細胞損傷以control組最重,normoxia+BMSCs組次之,Co+BMSCs組損傷最輕；再灌注后48h, Co+BMSCs組腎小管上皮細胞修復最明顯,且在再灌注后1周Co+BMSCs組未出現(xiàn)明顯腎小管上皮細胞萎縮等慢性化改變。3.MR掃描顯示,移植前I/R大鼠腎臟皮質信號增強,細胞移植的兩組腎臟皮質SI在移植后2h下降最明顯,且Co+BMSCs移植組腎臟皮質SI下降更明顯(P0.05),而腎臟髓質及腎盂SI無明顯變化；至移植后72h, normoxia+BMSCs組腎臟皮質△SI趨于0,而Co+BMSCs組腎皮質SI仍有明顯下降。 結論：1.SPION標記BMSCs安全、有效。2.與常氧培養(yǎng)BMSCs移植相比,低氧預處理BMSCs移植能更有效的改善I/R大鼠腎功能、修復腎臟損傷。3.低氧預處理可促進BMSCs向受損腎臟遷移歸巢、延長細胞在腎臟內的定植時間。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【共引文獻】

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本文編號：2381636