發(fā)布時(shí)間：2018-12-16 01:32

【摘要】：研究目的 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有再生修復(fù)、免疫調(diào)控、支持造血等重要功能，近年來已成為干細(xì)胞研究及應(yīng)用領(lǐng)域的熱點(diǎn)，主要用于治療免疫性、退行性及損傷性等多種難治性疾病。而臍帶（umbilical cord，UC）中MSCs含量豐富，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，受病毒等病原微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)低，非常適宜體外規(guī)�；瘮U(kuò)增、凍存及臨床應(yīng)用，而且臍帶作為胎兒娩出后的“廢棄物”，取材方便，對產(chǎn)婦及新生兒沒有任何風(fēng)險(xiǎn)，不存在倫理學(xué)問題。因此，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）有望成為可以規(guī)�；a(chǎn)的“干細(xì)胞治療藥物”。 當(dāng)然，對于細(xì)胞治療來說，安全性是首要關(guān)注和亟需研究的問題，特別是非人靈長類動(dòng)物（non-human primates，NHPs）在親緣關(guān)系上和人類最為接近，在組織結(jié)構(gòu)、病理生理、免疫調(diào)節(jié)和能量代謝等方面與人類高度近似，其研究價(jià)值明顯優(yōu)于其他種屬的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本課題旨在研究UC-MSCs輸注食蟹猴（Macacafascicularis）的毒性及主要免疫學(xué)指標(biāo)的影響，并建立食蟹猴臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Macaca fascicularis umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，mUC-MSCs）的培養(yǎng)及鑒定方法，為UC-MSCs的同種異體臨床應(yīng)用提供非人靈長類動(dòng)物的試驗(yàn)支持。 研究內(nèi)容與方法 1.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞重復(fù)靜脈輸注食蟹猴4周的毒性試驗(yàn)及主要免疫學(xué)指標(biāo)的影響。試驗(yàn)選用食蟹猴24只，隨機(jī)分為4組，分別為陰性對照組、溶劑對照組、低劑量組（2×106個(gè)/kg）、高劑量組（2×107個(gè)/kg）。每周靜脈輸注1次，連續(xù)5次，試驗(yàn)期間進(jìn)行臨床觀察、體重、體溫、心電圖、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血功能、血液生化、T淋巴細(xì)胞亞群（CD3、CD4、CD8及CD4/CD8）、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th1/Th2細(xì)胞因子（IFN-γ、IL2、IL-4、IL-6、IL-5、TNF）、T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、免疫球蛋白G及hUC-MSCs抗體等指標(biāo)的監(jiān)測。 2.食蟹猴臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性。通過剖宮產(chǎn)獲取食蟹猴臍帶，經(jīng)過機(jī)械粉碎、酶學(xué)消化、貼壁培養(yǎng)傳代，獲得食蟹猴臍帶MSCs，觀察細(xì)胞形態(tài)、繪制生長曲線、流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期及免疫表型、并鑒定其多向分化潛能。 3.食蟹猴臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞單次靜脈輸注食蟹猴的毒性試驗(yàn)及主要免疫學(xué)指標(biāo)的影響。試驗(yàn)選用食蟹猴3只，單次靜脈輸注mUC-MSCs（2×106個(gè)/kg）后，進(jìn)行臨床觀察、體重、體溫、心電圖、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血功能、血液生化、T淋巴細(xì)胞亞群、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th1/Th2細(xì)胞因子、免疫球蛋白G等指標(biāo)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測。 研究結(jié)果 1. hUC-MSCs重復(fù)靜脈輸注對食蟹猴的一般生理活動(dòng)、體重、體溫、心電圖、血常規(guī)、凝血功能、生化等指標(biāo)均未見有毒理學(xué)意義的不可逆的異常改變，注射局部也無明顯刺激性�？赡艿亩拘苑磻�(yīng)為PLT、血清TP、無機(jī)P的降低（P≤0.05）。hUC-MSCs重復(fù)靜脈輸注對食蟹猴的T淋巴細(xì)胞亞群、T淋巴細(xì)胞增殖能力、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、血清IgG等指標(biāo)均未發(fā)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響，僅在個(gè)別時(shí)間點(diǎn)觀察到IFN-γ、IL-4、IL-6與陰性對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在3只動(dòng)物體內(nèi)檢測到hUC-MSCs抗體。 2. mUC-MSCs形態(tài)呈梭形，第3代以后細(xì)胞的免疫表型顯示高表達(dá)CD29、CD73、CD90、CD105、CD166，不表達(dá)或低表達(dá)CD14、CD31、CD34、CD45、CD40、CD80、CD86、HLA-DR；在特定的體外誘導(dǎo)條件下，mUC-MSCs可以向骨、脂肪、軟骨分化，細(xì)胞周期檢測顯示G0/G1期細(xì)胞90%。 3. mUC-MSCs單次靜脈輸注對食蟹猴的一般生理活動(dòng)、體重、體溫、心電圖、凝血功能均未見有毒理學(xué)意義的異常改變。給藥后RBC、HGB、HCT有所下降，而Retic有所升高（P≤0.05）；藥后Glb有所下降，A/G有所升高（P≤0.05）；輸注mUC-MSCs后D3、D5、D7、D8的CD4+細(xì)胞與藥前比較顯著升高，藥后D7的CD8+細(xì)胞與藥前比較有所下降，，而藥后D3、D5、D7、D8的CD4+/CD8+比例與藥前比較亦顯著升高（P≤0.05）；藥后D4的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞較藥前有所升高（P≤0.05）；僅在個(gè)別時(shí)間點(diǎn)觀察到IL-4、IL-6、TNF的改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給藥前后T淋巴細(xì)胞增殖能力及IgG均未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的改變。 結(jié)論 1.本試驗(yàn)成功建立了食蟹猴臍帶MSCs的分離培養(yǎng)及鑒定方法，發(fā)現(xiàn)mUC-MSCs在細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、多向分化潛能等方面與目前報(bào)道的人臍帶MSCs相似，為同種異體臍帶MSCs的臨床前研究及應(yīng)用提供了非人靈長類動(dòng)物的研究基礎(chǔ)。 2.本試驗(yàn)從異種及同種異體兩種模式證明了臍帶MSCs靜脈輸注的安全性，在本試驗(yàn)條件下，hUC-MSCs重復(fù)靜脈輸注食蟹猴的安全劑量為2.0×107個(gè)/kg，該劑量是臨床擬用劑量的20倍。 3.本試驗(yàn)證實(shí)hUC-MSCs靜脈輸注對健康食蟹猴的外周血T淋巴細(xì)胞亞群、T淋巴細(xì)胞增殖能力、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、血清IgG、Th1/Th2細(xì)胞因子等免疫學(xué)指標(biāo)的影響微乎其微。但mUC-MSCs靜脈輸注對食蟹猴T淋巴細(xì)胞亞群、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞還是有所影響的，說明MSCs異種輸注和同種異體輸注對免疫系統(tǒng)的影響是有區(qū)別的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：2381634