【摘要】：疾病材料的獲得對人類疾病的研究是十分重要的。人類疾病的發(fā)生發(fā)展十分復(fù)雜,以人本身作為實驗和研究對象來深入探討疾病發(fā)生機制以及致病機理,對醫(yī)藥學(xué)發(fā)展的推動是十分緩慢的,而且許多涉及人體的實驗在道義上和方法上也受到限制。而疾病的動物模型由于種屬差異、解剖和生理的不同,很多先天或獲得性疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型不能真實的反映人類疾病的病理生理學(xué)。 誘導(dǎo)性多能性干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的出現(xiàn)使獲得病人特異性的多能性干細胞成為可能。由于iPSCs類似于胚胎干細胞(Embryonic stem cells, ESCs)具有多能性,而且可以避免限制胚胎干細胞臨床治療的組織相容性問題,對于多種疾病,病人特異的iPSCs作為無限的細胞來源不僅在建立疾病模型而且在藥物篩選和細胞替代治療上都具有巨大的潛力。 本研究利用iPS技術(shù)建立了十二種遺傳性疾病特異的誘導(dǎo)性多能性干細胞系,其中9種疾病的iPS系國際上尚無報道,并以血小板無力為例探討了疾病的iPS模型建立的可行性,為進一步的疾病機制研究和疾病治療奠定基礎(chǔ)。同時為了避免慢病毒感染方法所帶來的安全性問題以及外源DNA的參與,本研究探討了利用人胚胎干細胞胞質(zhì)重編程體細胞的可行性,對人胚胎干細胞胞質(zhì)可以重編程體細胞給出了直接證據(jù),’為獲得無外源DNA參與的病人特異的多能性細胞奠定了基礎(chǔ)。本研究分兩個部分,主要研究方法及結(jié)果如下： 第一章十二種疾病特異的iPS系和血小板無力iPS疾病模型的建立 第一節(jié)十二種疾病特異的iPS系的建立 目的：1、利用慢病毒感染方法建立人成纖維細胞來源的誘導(dǎo)性多能性干細胞,并與hESCs比較其分化能力；2、建立多種疾病的iPSCs細胞系； 方法：1、采用慢病毒感染的方法將Oct4/Sox2/Nanog/Lin28四種因子導(dǎo)入成纖維細胞獲得誘導(dǎo)性多能性細胞(iPSCs),對建立的iPSCs進行全面細致的鑒定,并且與本實驗室分離得到的hESCs對分化過程中三胚層分化基因以及全能性基因的表達進行比較；2、收集多種遺傳病病人皮膚的成纖維細胞,利用慢病毒感染方法建立多種疾病的iPSCs細胞系,并進行初步鑒定； 結(jié)果：1、利用慢病毒感染的方法有效建立了人流產(chǎn)胚胎皮膚成纖維細胞來源的iPSCs系,獲得iPS細胞的效率為10-5～-4,在表面標記,EB分化等方面獲得的iPS細胞與胚胎干細胞相似,并經(jīng)STR分析證實iPS確實來源于人胚胎成纖維細胞而非胚胎干細胞的污染；2、利用iPS技術(shù)建立了12種遺傳病病人特異的iPSCs系,這些細胞系均具有胚胎干細胞的典型特征,其中所檢測的細胞系均含有與其來源病人相同的基因突變或染色體改變。 結(jié)論：利用慢病毒感染的方法能有效的建立來自12種疾病病人的iPSCs系,其中9種疾病iPSCs國際上尚無相關(guān)報道,為進一步的疾病機制和疾病治療的研究提供了材料。 第二節(jié)血小板無力iPS疾病模型的建立及初步研究 目的：建立血小板無力(Glanzmann thrombasthenia, GT)患者特異的誘導(dǎo)性多能干細胞系,并將其向血小板方向誘導(dǎo)分化,探討血小板無力的iPSCs能否作為疾病模型有效的體外重現(xiàn)血小板無力的發(fā)生獲得具有疾病表型的血小板。 方法：利用慢病毒感染的方法將血小板無力患者皮膚活檢得到的成纖維細胞誘導(dǎo)得到血小板無力iPSCs (GT-iPSCs),并對其進行干細胞特性鑒定。同時利用基質(zhì)細胞共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)GT-iPSCs和hESCs向血小板方向誘導(dǎo)分化,并對得到的血小板進行表型檢測和聚集功能分析,并利用病毒感染的方法進行初步的基因糾正。 結(jié)果：從血小板無力患者的皮膚成纖維細胞建立了血小板無力iPSCs系,獲得的GT-iPSCs具有胚胎干細胞的典型特征。體外可以向三胚層分化,通過與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)可獲得血小板,與hESCs相比,誘導(dǎo)效率較低,獲得的血小板無CD41a與CD61的表達,ADP刺激不能發(fā)生活化和聚集。經(jīng)過基因修正后由GT-iPS得到的血小板樣的顆粒表達CD41a并且能夠參與微聚體的形成。 結(jié)論：首次利用慢病毒感染方法獲得了血小板無力的iPSCs,并能有效的體外重現(xiàn)疾病的發(fā)生,可作為進一步研究疾病機制和治療的疾病模型。將正常的CD41基因轉(zhuǎn)入GT-iPS細胞可以恢復(fù)血小板正常的聚集功能,說明在細胞水平上基因治療是有效的,為今后的基因治療開拓了一條新路。 第二章阻滯于有絲分裂中期(M期)的胚胎干細胞胞質(zhì)中體細胞重編程相關(guān)因子的檢測 目的：檢測從有絲分裂中期(M期)的人胚胎干細胞分離獲得的胞質(zhì)是否含有重編程體細胞必要的重編程因子如OCT4, NANOG等,從而為分裂中期的人胚胎干細胞胞質(zhì)具備重編程體細胞為病人特異的全能性細胞的能力提供依據(jù)。 方法：檢測了人胚胎干細胞中多能性相關(guān)因子OCT4/SOX2/NANOG在分裂期以及分裂間期細胞內(nèi)的定位,并將人胚胎干細胞進行同步化后使用密度梯度離心法分離處于M期的胚胎干細胞的細胞質(zhì),進行全能性相關(guān)因子的檢測。 結(jié)果：處于M期的人類胚胎干細胞胞質(zhì)含有OCT4、NANOG和SOX2等重編程相關(guān)因子；聯(lián)合應(yīng)用胸腺嘧啶和TN-16可使48.83%±7.99%的hESCs同步于M期；通過密度梯度離心可有效的去除hES的細胞核,獲得大量含有重編程因子的hES胞質(zhì)。 結(jié)論：本研究首次直接證實了阻滯于有絲分裂中期(M期)的人胚胎干細胞的胞質(zhì)包含有重編程相關(guān)的因子,并可通過密度梯度離心的方法獲得。對人類胚胎干細胞胞質(zhì)可以重編程體細胞給出了直接證據(jù),為獲得無外源DNA參與的病人特異的多能性細胞奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R-332

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 謝梅青;卵巢早衰的病因[J];實用婦產(chǎn)科雜志;2003年04期

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本文編號：2377255