【摘要】：人腺病毒41型(Adenovirus type41, Ad41)與人腺病毒40型構(gòu)成了腺病毒F組,F組腺病毒是十分重要的致病病原體,主要導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉,約占非細(xì)菌性腹瀉的5%-15%,僅次于輪狀病毒。F組腺病毒具有一下幾個(gè)特點(diǎn)。第一,該組病毒在體外難于培養(yǎng)傳代,即應(yīng)用常規(guī)培養(yǎng)傳代其他腺病毒的方法,不容易將F組腺病毒連續(xù)傳代培養(yǎng),因此又被稱為難養(yǎng)腺病毒(fastidious adenoviruses)第二、F組腺病毒具有腸道嗜性,該組病毒能夠經(jīng)受胃酸、膽汁、消化酶等作用而不失活。因?yàn)镕組腺病毒具有腸道嗜性的特性,所以其具有改造為消化道靶向載體的潛能,因此成為研究的熱點(diǎn)。第三、在病毒結(jié)構(gòu)方面,F組腺病毒是目前發(fā)現(xiàn)的人類腺病毒中唯一具有長、短兩種纖維突的腺病毒,而其它人類腺病毒僅有一種纖維突,其中長纖維突的重要功能之一是通過與CAR (Coxsackie and Adenovirus Receptor, CAR)結(jié)合,介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞,短纖維突的受體及功能至今不明。 本課題組己成功建立了能夠進(jìn)行Ad41連續(xù)培養(yǎng)傳代的細(xì)胞系293TE7.6,從而為Ad41研究提供了有利基礎(chǔ)。本文研究?jī)?nèi)容包括以下兩點(diǎn)： 一、Ad41病毒顆粒長、短兩種纖維突比例的研究。 通過原核表達(dá)、純化Ad41短纖維突蛋白(sFiber-P)及長纖維突蛋白(1Fiber-P),以定量的sFiber-P,1Fiber-P作為標(biāo)準(zhǔn)。通過Western blot檢測(cè)純化Ad41的短、長纖維突蛋白條帶,通過圖像分析軟件Gel-pro analyzer4.0對(duì)sFiber-P,1Fiber-P條帶及Ad41的短、長纖維突蛋白條帶進(jìn)行定量。結(jié)果表明Ad41的短、長纖維突蛋白的比例為5：1。為驗(yàn)證上述結(jié)果,我們構(gòu)建了短纖維突缺失的重組腺病毒Ad41DSF-GFP。研究結(jié)果表明,Ad41DSF-GFP的短纖維突的量為Ad41長纖維突的6倍,從而進(jìn)一步確證了Ad41的短、長纖維突蛋白的比例為5：1。熒光定量PCR結(jié)果表明,細(xì)胞內(nèi)Ad41短纖維突蛋白與長纖維突蛋白mRNA水平無明顯差異,Western blot結(jié)果表明, Ad41感染的細(xì)胞內(nèi)長纖維突蛋白量低于短纖維突蛋白量。上述結(jié)果表明,Ad41病毒上短纖維突與長纖維突數(shù)量不相等由轉(zhuǎn)錄后水平差異導(dǎo)致的。 對(duì)短纖維突的功能研究表明,Ad41-GFP感染效率為Ad41DSF-GFP的1.2-1.8倍,Ad41DSF-GFP的VP/IU值為Ad41-GFP的1.5倍,Ad41-GFP進(jìn)入細(xì)胞的速度也快于Ad41DSF-GFP。匕述結(jié)果表明,Ad41短纖維突具有輔助病毒進(jìn)入細(xì)胞的功能。 二、Ad41形態(tài)發(fā)生學(xué)研究 對(duì)Ad41的形態(tài)發(fā)生過程研究主要獲得以下結(jié)果： 病毒進(jìn)入細(xì)胞的方式：Ad41通過非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的入胞、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的入胞及直接進(jìn)入細(xì)胞三種方式進(jìn)入胞內(nèi),其中以非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的入胞方式為主,在病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程中細(xì)胞的微絨毛也發(fā)揮一定的作用。 病毒在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)：病毒進(jìn)入細(xì)胞后以以下三種方式向細(xì)胞核方向運(yùn)動(dòng)：包裹在囊泡內(nèi)、在溶酶體中以及以游離形式轉(zhuǎn)運(yùn)。病毒到達(dá)細(xì)胞核附近,病毒核衣殼內(nèi)成分通過細(xì)胞核孔進(jìn)入細(xì)胞核。 病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制：子代病毒顆粒首先出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi),子代病毒數(shù)量由少到多,排列方式由散在到大量病毒聚集或呈結(jié)晶狀排列。隨著時(shí)間的推移,子代病毒出現(xiàn)在細(xì)胞漿內(nèi),細(xì)胞漿內(nèi)的病毒顆粒也可以散在排列、聚集成團(tuán)或呈結(jié)晶狀排列。病毒在復(fù)制過程中可以誘導(dǎo)產(chǎn)生兩種包涵體,即纖維絲狀包涵體與致密包涵體,對(duì)包涵體進(jìn)行免疫膠體金標(biāo)記顯示,兩種包涵體均含有Ad41組分。其中纖維絲狀包涵體內(nèi)含有短、長纖維突蛋白成分。 病毒的釋放：隨著時(shí)間的增加,細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞漿內(nèi)病毒大量聚集或呈結(jié)晶狀排列,細(xì)胞核核膜界限模糊不清或消失,細(xì)胞質(zhì)膜破裂,病毒從細(xì)胞質(zhì)膜破裂處脫離細(xì)胞完成釋放過程,即病毒以裂細(xì)胞方式釋放。 子代病毒的再感染：從細(xì)胞內(nèi)釋放的子代Ad41吸附于其他細(xì)胞的表面,進(jìn)入細(xì)胞后繼續(xù)進(jìn)行下一代病毒的復(fù)制過程。 對(duì)Ad41的形態(tài)發(fā)生研究結(jié)果表明,Ad41形態(tài)發(fā)生過程與其他腺病毒沒有明顯區(qū)別,與Ad5相比Ad41產(chǎn)生的纖維絲狀包涵體有別于Ad5產(chǎn)生的包涵體形態(tài)。 綜上所述,本研究確定了Ad41短、長纖維突比例為5：1,初步證明Ad41短纖維突具有輔助病毒感染細(xì)胞的作用。上述結(jié)果為Ad41的結(jié)構(gòu)與功能研究提供了信息。本文還研究了Ad41的的吸附、入胞、復(fù)制、釋放等形態(tài)發(fā)生過程,并確定Ad41誘導(dǎo)產(chǎn)生的包涵體中含有Ad41成分,上述研究結(jié)果為Ad41的形態(tài)發(fā)生學(xué)提供了依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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1 韓炳娟;郭麗;屈建國;王敏;王健偉;魯茁壯;洪濤;;轉(zhuǎn)染E1B55K基因提高Hep2細(xì)胞包裝腸腺病毒Ad41的能力[J];病毒學(xué)報(bào);2007年04期

2 洪濤;陳良標(biāo);龐其方;周思敬;;陰性反差染色技術(shù)的探討[J];微生物學(xué)報(bào);1964年01期

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本文編號(hào)：2375798