發(fā)布時(shí)間：2018-12-09 20:47

【摘要】：EGFR即表皮生長因子受體,在多種人類腫瘤中存在過表達(dá)甚至高表達(dá),尤其是在肝癌、卵巢癌等實(shí)體瘤中,其表達(dá)水平更高。EGFR的過度表達(dá)及其特異性配體EGF、TGF-α等的結(jié)合可導(dǎo)致EGFR的異常激活;活化的EGFR可進(jìn)一步激活、調(diào)控多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移,并通過介導(dǎo)VEGF表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管新生,進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡性程度及預(yù)后等過程中發(fā)揮重要作用。因此,通過阻斷EGFR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以實(shí)現(xiàn)治療腫瘤的目的成為近年來腫瘤治療的熱點(diǎn)。目前,國外已有多種以EGFR為靶點(diǎn)的抗體藥物上市并在腫瘤臨床治療中表現(xiàn)出良好的治療效果,但我國尚沒有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗體上市。因此,研制具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型抗EGFR功能抗體具有重要的理論和實(shí)際意義。本論文借助本實(shí)驗(yàn)室建立的“基于抗原-抗體相互作用的空間結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)新型功能分子”的技術(shù)平臺(tái),根據(jù)上市抗體Erbitux特異性識(shí)別EGFR胞外區(qū)功能性抗原表位的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),通過計(jì)算機(jī)輔助分子模擬技術(shù)設(shè)計(jì)獲得了新型抗體MIL10,經(jīng)真核表達(dá)、純化及鑒定后,對(duì)抗體的功能活性及作用機(jī)制行了初步探討。具體研究方法及結(jié)果如下: 1、用于抗EGFR抗體篩選的腫瘤細(xì)胞系鑒定 EGFR在多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)異常,以上市抗EGFR功能性抗體Erbitux為陽性抗體,對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的多種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。流式細(xì)胞分析及Western blot等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、肝癌細(xì)胞系HepG2、乳腺癌細(xì)胞系MCF7等細(xì)胞表面均有不同的程度的EGFR異常表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)EGFR激活的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子活化程度檢測(cè)結(jié)果提示,卵巢癌細(xì)胞系SKOV3及肝癌細(xì)胞系HepG2中,AKT、EGFR等信號(hào)分子呈高水平磷酸化,并且這些分子的異常活化可以被功能性抗體Erbitux逆轉(zhuǎn)。同時(shí),在這兩種細(xì)胞中,配體EGF可特異性激活EGFR信號(hào),并且這種特異性的EGFR活化可以被抗體Erbitux抑制。提示,卵巢癌細(xì)胞系SKOV3及肝癌細(xì)胞系HepG2可以用于新型抗EGFR抗體的篩選鑒定。 2、新型抗EGFR功能抗體MIL10的設(shè)計(jì)、合成及鑒定 根據(jù)Erbitux與EGFR相互作用復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),在合適的分子力場(chǎng)下,經(jīng)力學(xué)優(yōu)化、動(dòng)力學(xué)模擬獲得Erbitux與EGFR相互作用的理論構(gòu)象。通過距離幾何學(xué)、計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)合理判定EGFR功能性抗原表位。借助本室建立的“基于抗原-抗體相互作用的空間結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)新型功能分子”的技術(shù)平臺(tái),根據(jù)Erbitux特異性識(shí)別EGFR胞外區(qū)功能性抗原表位的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),通過計(jì)算機(jī)輔助分子模擬技術(shù)合理設(shè)計(jì)新型抗體MIL10。理論分析顯示,該抗體識(shí)別EGFR的表位與Erbitux基本一致,推測(cè)具有與Erbitux相似的生物學(xué)功能。根據(jù)計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)的結(jié)果,通過基因全合成的方法獲得了MIL10抗體可變區(qū)基因,將其構(gòu)建到含IgG1亞型抗體恒定區(qū)基因的表達(dá)載體中,在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)。經(jīng)純化獲得的抗EGFR抗體分子量為155kDa;可以特異性地被羊抗人IgG識(shí)別。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MIL10可以特異性識(shí)別高表達(dá)EGFR的細(xì)胞系SKOV3及HepG2,其結(jié)合活性與Erbitux相似;并且可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制Erbitux與靶細(xì)胞的結(jié)合,表明MIL10與Erbitux識(shí)別相同的抗原表位。 3、MIL10的功能活性及其對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的影響 在獲得具有識(shí)別活性的抗EGFR抗體MIL10的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步評(píng)價(jià)了MIL10的生物學(xué)活性。抗體MIL10在體外具有與上市抗體Erbitux相似的功能活性:MIL10可以通過介導(dǎo)ADCC效應(yīng)特異性殺傷靶細(xì)胞,進(jìn)一步細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,MIL10可以明顯抑制高表達(dá)EGFR的SKOV3及HepG2細(xì)胞的遷移能力;同時(shí)能顯著降低細(xì)胞中VEGF及IGF-1等與腫瘤相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)水平。 在上述功能研究的基礎(chǔ)上,對(duì)MIL10發(fā)揮抑瘤效應(yīng)的信號(hào)機(jī)制進(jìn)行了初步探討。MIL10可顯著降低EGFR的活化水平,并且抑制下游通路中關(guān)鍵信號(hào)分子的活化,如PI3K/AKT信號(hào)通路中AKT的活化、MAPK/Erk信號(hào)通路中Erk的活化以及Src/STAT信號(hào)通路中STAT5的活化。提示,MIL10可以通過抑制EGFR信號(hào)通路的活化,發(fā)揮抗腫瘤作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王章桂;孫國平;;表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2007年12期

2 劉彤華;;表皮生長因子受體家族與靶向性抗癌治療[J];中華病理學(xué)雜志;2006年10期

，

本文編號(hào)：2370008