【摘要】：研究背景和目的 創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus, Vv)是弧菌屬第5群細菌,革蘭氏陰性,彎曲有莢膜的弧菌,主要生長在海水魚類及貝母類。根據(jù)其生化特性、流行病學模式以及宿主范圍將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個亞型,其中Ⅰ型Vv是導致人群創(chuàng)傷感染及原發(fā)性敗血癥的病原體。創(chuàng)傷弧菌感染一旦出現(xiàn)敗血癥,其病死率高達50%以上。原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌感染發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢。國內(nèi)1990年首次報道一例,隨后沿海各地區(qū)每年都有散發(fā)病例報道,其病死率一直居高不下。對本病的認識不足,發(fā)病早期未能正確診斷,或誤診為超敏反應而使用大劑量激素,是造成高病死率的主要原因。 在對創(chuàng)傷弧菌感染的診斷方面,由于創(chuàng)傷弧菌引起的腹瀉及最初的癥狀并無特異性,因而實驗室診斷成為最可靠的確診手段。目前細菌性食物中毒(包括創(chuàng)傷弧菌引起的食物中毒)的檢驗仍以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為主,但該方法操作繁瑣,費時費力,一般要經(jīng)過：①增菌；②選擇性增菌；③選擇性平板分離；④生化鑒定；⑤血清學鑒定。耗時較長,往往需要4天～7天甚至更長時間才能作出最終鑒定,且陽性率低,容易造成漏檢。而創(chuàng)傷弧菌感染具有起病急、迅速致死的特點,有臨床資料表明,住院到死亡時間平均為2天。因此迫切需要建立一種準確而又迅速的診斷方法。目前已建立了不少創(chuàng)傷弧菌檢測技術(shù),包括常規(guī)及復合PCR、核酸雜交、生物傳感器以及利用單克隆抗體建立的ELISA、乳膠凝集試驗等技術(shù)方法。Parker等建立了以創(chuàng)傷弧菌特異性抗體為基礎的酶免疫法,最低檢出量為2000個菌／孔,但操作繁瑣,條件要求較多,一般需要3-5 h才能完成檢測。PCR檢測方法的靈敏度高,文獻報道以創(chuàng)傷弧菌毒力相關基因vcg為目標序列,設計環(huán)介導等溫擴增法檢測環(huán)境中的創(chuàng)傷弧菌,靈敏度可達2.5×103 CFU/ml,且具有良好的特異性,但該方法對實驗室要求較高,不適合現(xiàn)場檢查所需。 能否建立一種快速方便的檢測方法,及時準確地對創(chuàng)傷弧菌污染及感染進行分析,為食品安全及臨床診斷提供有效證據(jù)呢?能否用試紙條對創(chuàng)傷弧菌進行快速檢測呢?國內(nèi)外尚未見相應方法報道,為此我們進行了研究,目的是建立一種適合于創(chuàng)傷弧菌簡便、快速、結(jié)果易于判斷的檢測方法。 方法： 1.創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體的純化及鑒定 (1)創(chuàng)傷弧菌標準株ATCC27562,購自中國科學院微生物研究所普通微生物保藏中心。復蘇培養(yǎng)后,進行革蘭氏染色,油鏡觀察,劃線接種于Marie Broth2216瓊脂平板,觀察其菌落形態(tài)。平板培養(yǎng)獲得獲得細菌,并進行活菌計數(shù),計算出細菌濃度,并通過甲醛固定法制備創(chuàng)傷弧菌菌體抗原。 (2)以創(chuàng)傷弧菌全菌抗原多次免疫新西蘭大白兔,制備兔抗創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體。采用辛酸-飽和硫酸銨法對多克隆抗血清進行純化；BCA法檢測純化后抗體蛋白濃度；SDS-PAGE法檢測抗體蛋白的純度,與純化前蛋白條帶的變化進行比較；PMSF法制備創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白,Western-Blotting法檢測抗體蛋白與細菌外膜蛋白免疫反應結(jié)果,觀察抗體蛋白的活性；間接ELISA法檢測純化前后抗體蛋白的效價的變化。 2.膠體金抗體探針的合成 (1)根據(jù)試紙條的側(cè)向流動和膠體金的示蹤功能,結(jié)合免疫學方法,建立創(chuàng)傷弧菌免疫層析試紙條。首先制備不同粒徑的膠體金顆粒,采用檸檬酸三鈉還原法,利用不同體積的還原劑制備五種不同粒徑的膠體金顆粒,紫外-可見光分光光度儀對上述膠體金進行400nm～700nm的光譜掃描,獲得最大的吸收波長、吸光值以及中位峰寬,并通過最大吸收峰波長計算出膠體金顆粒粒徑的大小。觀察不同粒徑膠體金的顏色,透明性及穩(wěn)定性,選擇合適的膠體金顆粒進行實驗。 (2)利用不同體積的K2C03溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值,偶聯(lián)抗體蛋白,檢測520nm和580nm吸光度A比值,即A520nm/A580nm比值,繪出K2CO3體積-吸光度變化曲線,確定最適K2C03的體積；以K2C03調(diào)節(jié)pH后的膠體金溶液,偶聯(lián)不同體積的抗體蛋白,檢測A520nm/A580nm比值,繪出蛋白抗體體積-吸光度變化曲線,確定最適抗體蛋白所需量。 (3)對金標抗體溶液穩(wěn)定劑及緩沖液進行優(yōu)化比較,選擇能有效保持金標溶液穩(wěn)定性及活性的條件。 3.創(chuàng)傷弧菌快速檢測試紙條研制 (1)將純化的兔抗創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體和羊抗兔IgG分別包被在硝酸纖維素膜檢測線和質(zhì)控線上,并經(jīng)封閉液處理,干燥。玻璃纖維素膜浸泡于膠體金-抗體復合物后,選擇適合的干燥條件。將吸水紙,硝酸纖維素膜,金標墊以及樣品墊依次粘貼至膠板上,組裝裁剪成試紙條。對創(chuàng)傷弧菌膠體金免疫層析試紙條的各項指標進行優(yōu)化,通過對創(chuàng)傷弧菌檢測試驗結(jié)果的觀察及LeicaQ500MC圖像分析系統(tǒng)定量分析比較,確定制備試紙條最佳條件。 (2)將試紙條插入樣品懸液中,待樣品層析完畢后觀察檢測結(jié)果。檢測線及質(zhì)控線處各出現(xiàn)一條紅線,則表示待檢樣品中有創(chuàng)傷弧菌,判為陽性；若僅在質(zhì)控線處出現(xiàn)一條紅線,則判為陰性；若質(zhì)控線不出現(xiàn)紅線,則表示測試失效。根據(jù)試紙條檢測結(jié)果對本試紙條的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性進行檢測分析。 (3)建立ELISA以及試紙條檢測方法的標準曲線,進行實際樣品中創(chuàng)傷弧菌添加回收試驗。 (4)利用常規(guī)培養(yǎng)及生化鑒定方法從水產(chǎn)品中分離弧菌菌株,并進行試紙條檢測試驗。 結(jié)果 創(chuàng)傷弧菌1.1758株在mariebroth2216瓊脂平板上為黃白色粘液半透明菌落,染色后觀察,革蘭氏染色陰性,彎曲,桿狀,多形性。1.創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體的純化及鑒定 創(chuàng)傷弧菌免疫新西蘭大白兔,獲得兔抗創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體血清。以辛酸-飽和硫酸銨法純化抗體血清,根據(jù)標準蛋白濃度及其相應的吸光度值,得到標準曲線,根據(jù)所測得的稀釋樣品的吸光度值,計算出相應的蛋白樣品濃度為12.5mg/ml。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析驗證在凝膠55kDa-61kDa之間出現(xiàn)蛋白條帶,純度較高。Western-Blotting檢測,抗體蛋白能有效地與創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白有效結(jié)合。經(jīng)間接ELISA檢測,純化后抗體蛋白效價為1：12800。2.膠體金抗體探針的合成 以檸檬酸三鈉還原法獲得五種不同粒徑大小的膠體金顆粒,分別為54.88nm、36.15nm、36.15nm、17.42nm、12.74nm,通過比較觀察不同粒徑膠體金的顏色,透明性,穩(wěn)定性及標記難易程度,金標抗體活性質(zhì)量,選擇最大吸收峰波長為520nm,粒徑大小為12.7nm的膠體金顆粒進標記實驗。通過吸光度A520nm/A580nm曲線比較試驗,確定制備膠體金抗體最優(yōu)體系為：每1ml膠體金加入9μl 0.1mol/L K2CO3及36μg的抗體蛋白。通過離心法純化膠體金抗體,選擇pH 8.2 O.Olmol/L硼酸(0.5%BSA,0.5%PEG20 000,15%蔗糖,0.05%Tween-20)作為金標抗體緩沖液。3.快速檢測創(chuàng)傷弧菌的膠體金免疫層析法的建立 (1)通過對試紙條檢測體系的優(yōu)化,通過定量分析,確定硝酸纖維素膜檢測線最佳包被抗體稀釋度為1：4,而質(zhì)控線為1：8；以1%牛血清白蛋白封閉1h,37。C(1h)烘干；浸泡有膠體金-抗體結(jié)合物的金標墊,4。C抽干方法干燥；0.01mol/l pH8.2硼酸,0.5%BSA,0.1%Tween-20,10%蔗糖處理樣品墊；硝酸纖維素膜,金標墊,樣品墊及吸收紙組裝結(jié)合成試紙條。 (2)構(gòu)建創(chuàng)傷弧菌膠體金免疫檢測試紙條,其檢測的靈敏度為2×106CFU/ml;特異性實驗顯示本試紙條與溶血性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動菌、肺炎克雷氏菌、嗜麥菌窄食單胞菌、產(chǎn)氣桿菌、陰溝腸桿菌、奇異變形菌、大腸埃希菌、痢疾桿菌、副溶血弧菌共12株菌均無交叉反應；穩(wěn)定性檢測表明該試紙條可4℃保存4個月；本試紙條回收率為70.68%-106.87%。 (3)通過生化鑒定方法獲得8株非創(chuàng)傷弧菌菌株,試紙條檢測結(jié)果與生化鑒定結(jié)果一致,未出現(xiàn)假陽性。 結(jié)論： 本研究成功研制出創(chuàng)傷弧菌免疫層析試紙條。本試紙條插入溶液后,20min-30min內(nèi)可觀察結(jié)果。本試紙條的檢測靈敏度為2×106 CFU/ml;與溶血性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動菌、肺炎克雷氏菌、嗜麥菌窄食單胞菌、產(chǎn)氣桿菌、陰溝腸桿菌、奇異變形菌、大腸埃希菌、痢疾桿菌、副溶血弧菌共12株菌均無交叉反應；穩(wěn)定性檢測表明該試紙條可4℃保存4個月。本試紙條可望在臨床檢驗、食品衛(wèi)生檢驗、野外環(huán)境檢驗(如野外作業(yè))及創(chuàng)口檢驗中應用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

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本文編號：2365849