【摘要】：目的 （1）克隆人白細(xì)胞介素-31（hIL-31）cDNA序列，構(gòu)建pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表達(dá)載體。 （2）將構(gòu)建成功的pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)hIL-31的細(xì)胞株，分離并純化hIL-31蛋白。 （3）使用不同濃度的hIL-31作用于HaCaT細(xì)胞，，探討其對(duì)IL-6、TNF-α mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)的影響。 （4）使用不同濃度的hIL-31作用于HaCaT細(xì)胞，探討其對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的影響。 方法 （1）采用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得人外周血單核細(xì)胞,培養(yǎng)之后加入終濃度為20nmol/L的PMA，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。 （2）Tizol法提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增hIL-31cDNA序列，并將其構(gòu)建到真核表達(dá)載體pSecTag2/Hygro B上。 （3）使用DNA轉(zhuǎn)染試劑盒將構(gòu)建成功的pSecTag2/Hygro B-IL-31轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞當(dāng)中，并使用潮霉素進(jìn)行篩選，獲得單個(gè)克隆后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離與純化。 （4）使用不同濃度的hIL-31干預(yù)HaCaT細(xì)胞，采用Real-Time PCR的方法分析其對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)的影響；ELISA法檢測(cè)其對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)的影響；MTT法分析其對(duì)細(xì)胞增殖的影響以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果 （1）經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測(cè)序分析鑒定,成功獲得hIL-31基因cDNA全長(zhǎng)序列和pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表達(dá)載體。 （2）成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)hIL-31的COS-7細(xì)胞株，并分離純化出IL-31蛋白。 （3）hIL-31能夠顯著誘導(dǎo)IL-6、TNF-α mRNA和蛋白水平的表達(dá)，并具有時(shí)間和劑量依賴效應(yīng)。 （4）小劑量、短時(shí)間的hIL-31抑制HaCaT細(xì)胞增殖的作用不明顯；高劑量、長(zhǎng)時(shí)間的hIL-31對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用。 （5）hIL-31可以改變HaCaT細(xì)胞周期，使得G1期細(xì)胞數(shù)量增加，S期和G2期細(xì)胞數(shù)量減少。 結(jié)論 （1）IL-31可以促進(jìn)HaCaT細(xì)胞IL-6和TNF-α mRNA和蛋白水平的表達(dá)。 （2）外源性的IL-31可以改變HaCaT的細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，并且其效應(yīng)具有時(shí)間和劑量依賴性。
[Abstract]:Objective (1) to clone human interleukin-31 (hIL-31) cDNA sequence and construct pSecTag2/Hygro B-IL-31 eukaryotic expression vector. (2) the successfully constructed pSecTag2/Hygro B-IL-31 eukaryotic expression vector was transfected into COS-7 cells, and the cell lines expressing hIL-31 stably were screened out, and the hIL-31 protein was isolated and purified. (3) the effects of different concentrations of hIL-31 on the expression of IL-6,TNF- 偽 mRNA and protein in HaCaT cells were studied. (4) HaCaT cells were treated with different concentrations of hIL-31 to investigate their effects on cell cycle and cell proliferation. Methods (1) Human peripheral blood monocytes were isolated from human peripheral blood by Lymphocyte isolate. After culture, PMA, with final concentration of 20nmol/L was added to culture for 24 hours, and then the cells were collected. (2) the total RNA,RT-PCR of the cells was extracted by Tizol to amplify the hIL-31cDNA sequence and constructed into the eukaryotic expression vector pSecTag2/Hygro B. (3) DNA transfection kit was used to transfect the constructed pSecTag2/Hygro B-IL-31 into COS-7 cells, and hygromycin was used to screen the cells. The protein was separated and purified by nucleic acid protein detector. (4) HaCaT cells were treated with different concentrations of hIL-31, and the expression of IL-6,TNF- 偽 mRNA in HaCaT cells was analyzed by Real-Time PCR, and IL-6,TNF- 偽 protein expression in HaCaT cells was detected by ELISA assay. The effect of MTT on cell proliferation and the effect of flow cytometry on cell cycle were analyzed. Results (1) the full-length cDNA sequence of hIL-31 gene and the eukaryotic expression vector of pSecTag2/Hygro B-IL-31 were successfully obtained by double digestion of colony PCR, and sequencing analysis. (2) COS-7 cell lines expressing hIL-31 stably were successfully screened, and IL-31 protein was isolated and purified. (3) hIL-31 could significantly induce the expression of IL-6,TNF- 偽 mRNA and protein in a time and dose dependent manner. (4) the inhibitory effect of hIL-31 on the proliferation of HaCaT cells was not obvious at low dose and short time, but the proliferation of HaCaT cells was inhibited by high dose and long time hIL-31. (5) hIL-31 could change the cell cycle of HaCaT cells and increase the number of cells in G1 phase, and decrease the number of cells in S phase and G2 phase. Conclusion (1) IL-31 can promote the expression of IL-6 and TNF- 偽 mRNA and protein in HaCaT cells. (2) exogenous IL-31 could change the cell cycle of HaCaT and inhibit cell proliferation in a time and dose-dependent manner.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2365742