【摘要】：霍亂弧菌(vibrio cholerae)屬于弧菌屬,革蘭氏陰性菌,是人類烈性腸道傳染病霍亂的病原菌,若不及時(shí)救治死亡率高達(dá)50%以上。據(jù)報(bào)道全球每年由O1群和O139群引起200萬(wàn)霍亂病例,以亞洲、非洲和拉丁美洲流行較為嚴(yán)重,非O1和O139群是引起我國(guó)部分地區(qū)腹瀉爆發(fā)流行的主要病原菌,因此檢測(cè)霍亂弧菌是有效控制和防治該病的關(guān)鍵。 霍亂弧菌檢測(cè)方法很多,如分離培養(yǎng)法、血清學(xué)方法和PCR法等,但各有其無(wú)法避免的缺點(diǎn)而限制了推廣使用。膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)是以膠體金為標(biāo)記物,具有快速簡(jiǎn)便、特異敏感、穩(wěn)定性強(qiáng)、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物檢疫、食品安全監(jiān)督等各領(lǐng)域�；魜y弧菌膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條國(guó)內(nèi)外已有上市產(chǎn)品,但多采用霍亂弧菌多糖抗原制備檢測(cè)用抗體,致使特異性減低或生產(chǎn)成本過(guò)高而不利于推廣。 外膜蛋白W(OmpW)和外膜蛋白U(OmpU)在霍亂弧菌的不同血清群中都存在,具有較好抗原性,機(jī)體感染霍亂弧菌后可產(chǎn)生OmpW和OmpU的特異性抗體。OmpW和OmpU是霍亂弧菌的潛在粘附因子,在細(xì)菌侵襲腸道過(guò)程中起一定作用,可能與細(xì)菌侵襲性和毒力有關(guān)。OmpW作為一種遺傳保守、種特異性抗原,在霍亂弧菌不同血清群中均低水平表達(dá),可以作為霍亂弧菌檢測(cè)的候選靶點(diǎn)。OmpU是一種孔通道蛋白,功能與大腸桿菌外膜蛋白F(OmpF)相似,但核苷酸序列不具有同源性。OmpU占外膜蛋白總量的30%左右,含鹽環(huán)境中可達(dá)到60%。本研究為國(guó)家傳染病重大專項(xiàng)資助課題,利用基因工程技術(shù)獲得霍亂弧菌重組蛋白OmpW和OmpU(r-OmpW和r-OmpU),制備多克隆抗體,期望該抗體能夠用于霍亂弧菌的快速檢測(cè)。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果主要包括以下三個(gè)部分: 一、庫(kù)存霍亂弧菌的鑒定 為保證研究所用的模板和檢測(cè)靶標(biāo)具有準(zhǔn)確性,我們首先對(duì)庫(kù)存的弧菌進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定。本實(shí)驗(yàn)首先將31株霍亂弧菌弧菌分別接種堿性蛋白胨水復(fù)蘇培養(yǎng)6-8h后,吸取少量菌液接種胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)12h,菌落呈圓形凸起、表面光滑、邊緣整齊,革蘭氏染色呈陰性,顯微鏡下觀察可見(jiàn)菌體短小,稍彎曲呈弧狀或逗點(diǎn)狀,暗視野下呈流星樣或穿梭狀運(yùn)動(dòng)。在形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上,應(yīng)用API 20NE系統(tǒng)將31株弧菌進(jìn)行生化鑒定,結(jié)果顯示27株屬于霍亂弧菌,而另外4株為其它弧菌。根據(jù)霍亂弧菌種特異性抗原ompW基因設(shè)計(jì)特異性引物,從基因水平鑒定霍亂弧菌,與API 20NE鑒定結(jié)果一致,顯示機(jī)檢的準(zhǔn)確率高于手檢。為確定霍亂弧菌的血清群及血清型,應(yīng)用O1群多價(jià)診斷血清、O1群小川型診斷血清、O1群稻葉型診斷血清和O139群診斷血清進(jìn)行血清學(xué)鑒定,結(jié)果此次鑒定的27株霍亂弧菌中,860064菌株、860065菌株、860066菌株、860067菌株、860068菌株、860069菌株、86006-10菌株和860120菌株屬于O1群小川型;860071菌株、860072菌株、860075菌株、860077菌株、860081菌株、860082菌株、860083菌株、860101菌株、860112菌株、860118菌株和860121菌株屬于O1群稻葉型;860091菌株、860106菌株和860111菌株屬于O1群彥島型;病人1菌株、環(huán)境2菌株和環(huán)境3菌株屬于O139群;17015菌株和17018菌株屬于非O1和O139群。 二、霍亂弧菌OmpW和OmpU的原核表達(dá)及抗原性分析 根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的霍亂弧菌ompW和ompU基因序列設(shè)計(jì)引物,以霍亂弧菌860069株基因組DNA為模板,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerse chain reaction, PCR)擴(kuò)增得到除信號(hào)肽外的ompW核心序列和ompU基因序列。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為588bp和1026bp,與預(yù)期大小一致。將目的片段與克隆載體pMD18-T連接,分別構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-T-ompW和pMD18-T-ompU,轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞,獲得含有目的基因序列的克隆菌株。該菌株經(jīng)PCR鑒定后,提取陽(yáng)性重組克隆質(zhì)粒,經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I雙酶切后回收目的條帶,將其與相同雙酶切后的表達(dá)載體pET32a連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-ompW和pET32a-ompU,轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定,陽(yáng)性菌株經(jīng)測(cè)序后,利用NCBI BLAST序列比對(duì)分析相似性均為99%,開(kāi)放讀碼框正確,保證了r-OmpW和r-OmpU一級(jí)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。由于融合了硫氧還蛋白,得到的r-OmpW和r-OmpU的分子量分別為41kDa和57kDa。SDS-PAGE分析顯示r-OmpW和r-OmpU在37℃誘導(dǎo)5h時(shí)表達(dá)量最大,約占全部菌體蛋白的53%和57%。將誘導(dǎo)菌體超生破碎,發(fā)現(xiàn)r-OmpW和r-OmpU均以包涵體形式高效表達(dá)。經(jīng)尿素變性及梯度透析復(fù)性純化后,純度均在90%以上。Western Blot結(jié)果表明:r-OmpW和r-OmpU能和霍亂弧菌免疫兔血清反應(yīng),具有較好抗原性。 純化的r-OmpW和r-OmpU蛋白按常規(guī)方法免疫新西蘭大耳白兔,雙向瓊脂糖檢測(cè)抗體效價(jià)可達(dá)1:32。Western Blot結(jié)果顯示OmpW和OmpU多克隆抗體均能與O1群古典型和EL Tor型、O139群霍亂弧菌特異性結(jié)合,可進(jìn)一步用于檢測(cè)霍亂弧菌。 三、霍亂弧菌rOmpW和rOmpU抗體在膠體金免疫層析檢測(cè)中的初步應(yīng)用 本研究利用檸檬酸三鈉還原法制備直徑約為25-30nm的膠體金顆粒,分別標(biāo)記rOmpW和rOmpU抗體,優(yōu)化標(biāo)記條件,確定穩(wěn)定膠體金最適抗體濃度為30μg/ml,最佳標(biāo)記pH值為9.0,得到的金標(biāo)探針在520nm處的A值分別為3.51和4.05,在適宜的A值(2.5~10)范圍內(nèi),符合設(shè)計(jì)要求。應(yīng)用rOmpW和rOmpU抗體包被硝酸纖維素膜的最適濃度均為4mg/ml。 霍亂弧菌rOmpW和rOmpU抗體在膠體金免疫層析的初步應(yīng)用結(jié)果顯示:2種抗體對(duì)27株霍亂弧菌檢測(cè)均為陽(yáng)性,最低檢測(cè)濃度均為均為1.8×10~8cfu/ml。結(jié)果還顯示2種抗體膠體金試紙條均發(fā)生交叉反應(yīng),其中,rOmpW抗體的試紙條與副溶血性弧菌860160菌株發(fā)生交叉反應(yīng),rOmpU抗體的試紙條與創(chuàng)傷弧菌870101菌株和副溶血性弧菌860160菌株發(fā)生交叉反應(yīng),可能與弧菌屬部分菌株的氨基酸序列之間具有同源性有關(guān),有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張付賢;王興龍;;免疫膠體金技術(shù)影響因素分析[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2009年05期

2 王穎芳;段廣才;謝婧;郗園林;范清堂;;霍亂弧菌O139和ElTor菌株毒力島區(qū)域分子特征比較[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年06期

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本文編號(hào)：2345156