【摘要】：第一部分體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法的建立 目的探討并建立體外培養(yǎng)并應(yīng)用5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-aza）誘導(dǎo)人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法，同時(shí)探索誘導(dǎo)分化的合適5-aza濃度，為基礎(chǔ)和臨床hUCMSCs移植修復(fù)損傷心肌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法足月順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)患者的臍帶在無(wú)菌條件下剪碎后采用貼壁培養(yǎng)法分離、純化hUCMSCs,采用終濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L及40μmol/L的5-aza對(duì)P3代hUCMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)24h后去除5-aza繼續(xù)培養(yǎng)4周,采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)學(xué)的變化,流式細(xì)胞儀測(cè)定hUCMSCs表面免疫標(biāo)記。同時(shí)免疫組織化學(xué)方法測(cè)定各組心肌細(xì)胞特異蛋白肌鈣蛋白(cTnI)的表達(dá)，不同濃度組分別隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)cTn I陽(yáng)性細(xì)胞的百分率(%)即誘導(dǎo)分化率。 結(jié)果采用貼壁培養(yǎng)法可從臍帶組織獲得大量hUCMSCs，誘導(dǎo)前呈典型的梭形；誘導(dǎo)后1~2周細(xì)胞體積變大,紡錘形細(xì)胞比例下降,多數(shù)細(xì)胞呈桿狀,少部分細(xì)胞呈不規(guī)則外形、長(zhǎng)梭形或橢圓形；3～4周后相鄰細(xì)胞間胞膜有接觸,逐漸相連呈肌管狀,細(xì)胞核質(zhì)比例明顯降低,胞質(zhì)內(nèi)有細(xì)小的顆粒樣結(jié)構(gòu),且顆粒樣結(jié)構(gòu)多聚集于細(xì)胞核周圍，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果表明，hUC MSCs表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD90、CD105，不表達(dá)CD31、CD34、CD45、HLA-DR，且經(jīng)反復(fù)多次傳代后，，抗原表達(dá)無(wú)明顯改變。在加入5-aza后24h，在不同濃度的實(shí)驗(yàn)組中均有不同程度的hUC MSCs死亡現(xiàn)象，其中5μmol/L和10μmol/L的5-aza組僅有少量細(xì)胞(5%左右)死亡，而20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L濃度的5-aza組約35%的細(xì)胞死亡。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,高濃度組(10μmol/L組)細(xì)胞死亡的數(shù)量也隨之增加，至第4周，20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L濃度的5-aza組死亡細(xì)胞數(shù)已增加到60%以上,而5μmol/L和10μmol/L的5-aza組死亡細(xì)胞數(shù)在10%左右。5-aza誘導(dǎo)4周后免疫組織化學(xué)鑒定cTnI表達(dá)陽(yáng)性，5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L及40μmol/L的5-aza誘導(dǎo)組cTnI陽(yáng)性細(xì)胞的比率分別為(13.20±3.03)%、(32.20±3.35)%、(25.60±2.30)%、(24.40±3.51)%及(22.60±2.41)%；對(duì)照組未見(jiàn)肌管狀細(xì)胞出現(xiàn)，免疫組織化學(xué)鑒定cTnI表達(dá)陰性，cTnI陽(yáng)性細(xì)胞的百分率(%)為0，經(jīng)方差分析結(jié)果得出各組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.05)。比較兩組之間的差異,采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn),結(jié)果示5μmol/L和10μmol/L5-aza誘導(dǎo)組之間及與其他組之間都有差異(P 0.05),20μmol/L、30μmol/L和40μmol/L5-aza誘導(dǎo)組之間沒(méi)有差異，其中分化率最高的為10μmol/L5-aza誘導(dǎo)組。 結(jié)論人臍帶貼壁培養(yǎng)可獲得大量的hUC MSCs，hUCMSCs體外經(jīng)5-aza誘導(dǎo)可定向分化為心肌細(xì)胞，10μmol/L的5-aza是誘導(dǎo)hUCMSCs向心肌細(xì)胞分化的最佳濃度。 第二部分5-氮雜胞苷誘導(dǎo)人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的分子機(jī)制探討 目的：研究GATA4、Nkx2.5基因在5-aza誘導(dǎo)hUCMSCs分化為心肌細(xì)胞過(guò)程中的表達(dá)水平，探討5-aza誘導(dǎo)hUCMSCs分化為心肌細(xì)胞的相關(guān)分子機(jī)制。 方法：足月順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)患者的臍帶在無(wú)菌條件下剪碎后采用貼壁培養(yǎng)法分離、純化hUCMSCs,10μmol/L5-aza對(duì)P3代hUCMSCs誘導(dǎo)24h后繼續(xù)培養(yǎng)4w，實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)誘導(dǎo)前后GATA4、Nkx2.5基因表達(dá)。 結(jié)果：1、4w后誘導(dǎo)組Nkx2.5、GATA4mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，分別較誘導(dǎo)前（對(duì)照組）增加了（4.72±0.58）、（3.76±0.06）倍。2、Nkx2.5Ct值：誘導(dǎo)前（對(duì)照組）為12.91±0.39，誘導(dǎo)后（誘導(dǎo)組）為8.19±0.95（t=2.80，P0.05）。3、GATA4Ct值：誘導(dǎo)前（對(duì)照組）為15.87±1.06，誘導(dǎo)后（誘導(dǎo)組）為12.10±1.01（t=3.19，P0.05）。所有測(cè)定的Ct值均經(jīng)GAPDH校正。 結(jié)論：5-aza誘導(dǎo)后hUCMSCs的GATA4、Nkx2.5表達(dá)上調(diào)，可能通過(guò)對(duì)GATA4、Nkx2.5基因表達(dá)的調(diào)控而促進(jìn)hUCMSCs分化為心肌樣細(xì)胞及促進(jìn)其成熟。 第三部分DLL4-Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在5-氮雜胞苷誘導(dǎo)人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞過(guò)程中的表達(dá)變化 目的研究Dll4-Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在5-aza誘導(dǎo)hUCMSCs分化為心肌細(xì)胞過(guò)程中的表達(dá)水平，探討其是否參與hUCMSCs分化為心肌細(xì)胞過(guò)程。 方法足月順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)患者的臍帶在無(wú)菌條件下剪碎后采用貼壁培養(yǎng)法分離、純化hUCMSCs,5-aza對(duì)P3代hUCMSCs誘導(dǎo)分化。分別在誘導(dǎo)后1、3、5、7d收集細(xì)胞,提取總RNA,以GAPDH為內(nèi)參照,利用RT-PCR檢測(cè)hUCMSCs誘導(dǎo)后誘導(dǎo)組和對(duì)照組不同時(shí)間Notch1、Dll-4基因表達(dá)水平。 結(jié)果誘導(dǎo)組和對(duì)照組培養(yǎng)第1、3、5、7天hUCMSCs的Notch1基因表達(dá)比較，誘導(dǎo)組Notch1基因表達(dá)量明顯升高，且表達(dá)穩(wěn)定，未隨著時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)減弱，而對(duì)照組Notch1表達(dá)較弱，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量有減少傾向。相對(duì)于對(duì)照組，誘導(dǎo)組第1、3、5、7天Notch1基因表達(dá)分別增加6.60、7.36、7.595、7.805倍。誘導(dǎo)組4天Notch1基因表達(dá)平均Ct值0.51±0.21，對(duì)照組4天Notch1基因表達(dá)平均Ct值7.85±0.35（t=35.98, P0.01）。誘導(dǎo)組Dll4基因表達(dá)量明顯升高，且表達(dá)穩(wěn)定，未隨著時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)減弱，而對(duì)照組Dll4表達(dá)較弱。與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組第1、3、5、7天Dll4基因表達(dá)分別增加11.53、10.1、10.17、11.46倍。誘導(dǎo)組4天Dll4基因表達(dá)平均Ct值1.60±0.49，對(duì)照組4天Dll4基因表達(dá)平均Ct值12.42±0.73（t=11.71,P0.01）。 結(jié)論利用5-aza誘導(dǎo)hUCMSCs向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中,Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Notch1、Dll4分子的表達(dá)明顯增高,提示Dll4-Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與了5-氮雜胞苷誘導(dǎo)hUCMSCs向心肌細(xì)胞的分化過(guò)程。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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2 法憲恩;王利霞;侯劍峰;張瑞成;王海永;;5-氮胞苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化觀察[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年06期

3 伍長(zhǎng)學(xué);張爾永;楊思遠(yuǎn);馬建e

本文編號(hào)：2344384