【摘要】：目的：觀察在白介素-27（Interleukin-27, IL-27）單獨(dú)作用或與TNF-α（Tumor necrosis factor-α, TNF-α）的聯(lián)合作用的情況下，對(duì)健康成年人外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood monocyte, PBMC）來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cell, DC）分化、成熟和生物學(xué)功能的影響，并探討其作用機(jī)制。 方法： 1.采集正常健康人外周血15~20ml，用Ficoll-hypaque（葡聚糖-泛影葡胺）密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入基礎(chǔ)細(xì)胞因子粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor, GM-CSF）和IL-4體外培養(yǎng)5d，得到未成熟的DC。在第5d時(shí)加入刺激因子，并根據(jù)加入刺激因子的不同分為四個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為：陰性對(duì)照組（Negative：不加入任何刺激因子）、陽(yáng)性對(duì)照組（TNF-α：20ng/ml）、IL-27組（IL-27：20ng/ml）、TNF-α+IL-27組（即雙細(xì)胞因子組，TNF-α：10ng/ml+IL-27：10ng/ml）。 2.利用倒置顯微鏡，分別觀察培養(yǎng)至第1d、3d、5d和7d各組未成熟及成熟DC的形態(tài)。 3.通過(guò)磁珠分選的方法分離各組DC。 4.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組DC表面共刺激分子CD1a、CD83和CD80、CD86以及細(xì)胞表面粘附分子ICAM-1的表達(dá)水平。 5.通過(guò)RT-PCR的方法檢測(cè)各組DC表面趨化因子受體CCR5、CCR7mRNA的表達(dá)情況。 6.用MTS的方法檢測(cè)各組DC經(jīng)絲裂霉素C處理后，刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力。 7.用ELISA的方法檢測(cè)各組DC培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ的分泌水平。 8.用Western-blot的方法檢測(cè)各組DC信號(hào)通路蛋白MAPKp38、P-STAT1和P-STAT3的含量。 結(jié)果： 1.光鏡下，在培養(yǎng)至第5天時(shí)，各組細(xì)胞形態(tài)均一，呈集落狀生長(zhǎng)，體積較小且胞體較圓。培養(yǎng)至第7天時(shí)，IL-27組和TNF-α+IL-27組DC呈現(xiàn)典型的成熟形態(tài)學(xué)特征，胞體較大，細(xì)胞伸出偽足，表現(xiàn)出明顯的毛刺樣結(jié)構(gòu)，與陽(yáng)性對(duì)照TNF-α組相比無(wú)明顯差別；而Negative組細(xì)胞胞體較小，表面毛刺狀突起較少，無(wú)典型DC形態(tài)。 2.流式細(xì)胞結(jié)果顯示，外周血單個(gè)核細(xì)胞于體外誘導(dǎo)培養(yǎng)第7d時(shí),Negative組、TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC表面共刺激分子CD1a和CD83雙陽(yáng)性率分別為23.29±4.49%、42.76±3.50%、35.75±4.10%和52.49±2.65%，CD80和CD86雙陽(yáng)性率分別為22.66±3.20%、45.56±2.47%、39.06±1.61%和54.10±0.46%。其中IL-27組與TNF-α組相比CD1a和CD83、CD80和CD86的雙陽(yáng)性率均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而TNF-α+IL-27組的雙陽(yáng)性率顯著高于TNF-α組和IL-27組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。Negative組、TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC表面粘附分子ICAM-1的陽(yáng)性率分別為為21.84±0.64%、27.66±1.03%、28.47±0.94%、35.11±1.32%，其中TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組的陽(yáng)性率均高于Negative組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而這三組之間ICAM-1的陽(yáng)性率相比則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 3. RT-PCR結(jié)果顯示，Negative組、TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC表面趨化因子受體CCR7mRNA的表達(dá)水平分別為3.09±0.18、4.14±0.08、3.98±0.09、4.75±0.11，其中TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組CCR7mRNA的表達(dá)水平顯著高于Negative組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)各組之間的比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。四組DC表面CCR5mRNA的表達(dá)水平分別為1.23±0.03、0.86±0.02、0.99±0.03、0.61±0.02，其中TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組CCR5mRNA的水平低于Negative組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），且TNF-α+IL-27組CCR5mRNA的表達(dá)水平與TNF-α組和IL-27組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而IL-27組與TNF-α組的表達(dá)水平無(wú)差異（P＞0.05）。 4. MTS結(jié)果顯示，TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC經(jīng)絲裂霉素C處理后，可明顯刺激T細(xì)胞增殖。隨DC與T細(xì)胞比例增加（1:100、1:50及1:10），刺激T細(xì)胞的能力增強(qiáng)。在DC與T細(xì)胞的不同比例下，TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組的刺激作用顯著高于Negative組，，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，DC與T淋巴細(xì)胞的比例在1：100和1:50時(shí)，TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組的吸光度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)DC與T細(xì)胞比例在1:10時(shí)，TNF-α+IL-27組吸光度值顯著高于TNF-α組和IL-27組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而IL-27組與TNF-α組吸光度值相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 5. ELISA結(jié)果顯示，Negative組、TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-12的分泌水平分別為37.24±2.34pg/ml、45.83±1.09pg/ml、44.78±0.78pg/ml、49.82±0.76pg/ml，其中TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC培養(yǎng)上清中IL-12的分泌水平顯著高于Negative組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，IL-27組與TNF-α組、TNF-α+IL-27組的分泌水平相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而TNF-α+IL-27組與TNF-α組之間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IFN-γ在各組的分泌水平分別為666.67±42.28pg/ml、831.90±69.88pg/ml、863.96±37.99pg/ml、1009.09±13.90pg/ml，其中TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC培養(yǎng)上清中IFN-γ的分泌水平顯著高于Negative組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，IL-27組與TNF-α組比較分泌水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但TNF-α+IL-27組DC IFN-γ的分泌水平較TNF-α組和IL-27組相比則顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 6. Western-blot結(jié)果顯示，TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組信號(hào)通路蛋白MAPKp38、P-STAT1、P-STAT3水平均有不同程度升高，升高趨勢(shì)以TNF-α+IL-27組更為明顯。 結(jié)論： 1.單獨(dú)使用IL-27或與TNF-α協(xié)同作用，可誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的DC成熟。 2.經(jīng)過(guò)IL-27誘導(dǎo)分化的DC，刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng)，而且在培養(yǎng)上清中，分泌大量的IL-12和IFN-γ，這說(shuō)明IL-27可以增強(qiáng)DC的生物學(xué)功能。 3.細(xì)胞因子IL-27可以直接或者協(xié)同TNF-α誘導(dǎo)DC成熟，其機(jī)制可能通過(guò)活化MAPKp38、P-STAT1、P-STAT3等信號(hào)通路。 4.兩種細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用，減少細(xì)胞毒性，增強(qiáng)細(xì)胞功能，具有更好的抗腫瘤作用，而且符合臨床用藥的配伍原則，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2344283