【摘要】：背景： 原林教授提出的筋膜學(xué)“兩系統(tǒng)理論”認(rèn)為：人體由非特異性結(jié)締組織筋膜支架所構(gòu)成的支持與儲備系統(tǒng)和被該筋膜支架所包繞的功能系統(tǒng)所構(gòu)成。支持與儲備系統(tǒng)以干細(xì)胞為核心,可為功能系統(tǒng)的更新提供細(xì)胞補(bǔ)充,并為功能系統(tǒng)的各種功能細(xì)胞的更新、代謝提供一個(gè)較為穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境和干細(xì)胞源。疏松結(jié)締組織是支持與儲備系統(tǒng)重要的組成部分,其中的脂肪源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是機(jī)體重要的干細(xì)胞儲備之一。支持與儲備系統(tǒng)使生物維持較長的生命周期和維持機(jī)體穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。疏松結(jié)締組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)構(gòu)成了支持與儲備系統(tǒng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。該學(xué)說的“損傷修復(fù)機(jī)制”認(rèn)為,機(jī)體在受外界刺激作用而損傷時(shí),通過動員支持與儲備系統(tǒng)(機(jī)體非特異性的結(jié)締組織)中未分化的干細(xì)胞,經(jīng)增殖,不斷為功能系統(tǒng)提供源源不斷的干細(xì)胞源,并分化成各種定向干細(xì)胞、進(jìn)而分化成功能細(xì)胞來修復(fù)機(jī)體損傷,維持機(jī)體的穩(wěn)定。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,在人體受到創(chuàng)傷時(shí),間充質(zhì)干細(xì)胞通過增殖、分化來修復(fù)損傷。骨損傷作為一種常見的創(chuàng)傷,可能具有相同或相似的損傷修復(fù)機(jī)制。 ADSCs是目前干細(xì)胞的研究熱點(diǎn)之一。作為一種新的MSCs,其具備了成體干細(xì)胞(Adult stem cells, ASCs)的特征,具有自我增殖和多向分化的能力。能在一定的條件下分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。近期的研究發(fā)現(xiàn),和骨髓干細(xì)胞(Bone marrow stem cell, BMSCs)相比,ADSCs具有取材手術(shù)小、可重復(fù)進(jìn)行、酶消化分離程序簡單等優(yōu)點(diǎn),可以作為新的成體干細(xì)胞來源。ADSCs是一種能夠自我更新,并且具有多種分化潛能的新型干細(xì)胞,可用于急性或慢性組織損傷的修復(fù)與再生,誘導(dǎo)后移植到骨缺損部位可修復(fù)骨缺損。 成骨細(xì)胞(Osteoblast, OB)主要由MSCs分化而來,其發(fā)育分化過程主要經(jīng)歷四個(gè)階段,即細(xì)胞增殖、基質(zhì)分泌、基質(zhì)成熟和礦化形成等。該過程受一系列細(xì)胞因子、信號分子和周圍環(huán)境因素等的影響和控制,包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、轉(zhuǎn)化生長因子2β(transforming growth factor-p,TGF2-p)、鈣黏附蛋白(cadherins)等。其中BMP具有非常重要的作用,通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo),具有誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨的作用。BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族的一員,在成骨細(xì)胞的發(fā)育過程中具有非常重要的作用,能夠促進(jìn)骨的形成。而骨形成的關(guān)鍵在于基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,BMP在誘導(dǎo)MSCs成骨、修復(fù)骨損傷過程中具有非常重要的作用。BMP及其下游的級聯(lián)蛋白組成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)通過影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,如：核心結(jié)合因子α(Core-binding factorα1, Cbfα1), Osterix (OSX), Dlx5/Msx2等的表達(dá),或是直接作用于成骨細(xì)胞特異性蛋白,如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP),骨鈣素(osteocalcin, OCN)的mRNA,從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化,刺激骨形成。BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是：BMPs首先與Ⅱ型受體和Ⅰ型受體結(jié)合,Ⅰ型受體磷酸化Drosophila mothers against decapentaplegic protein (Smads), Smads進(jìn)入核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子相互作用影響相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄。Smads可分為受體調(diào)節(jié)Smads(R-Smads:Smad1、2、3、5、8和9)、共同介導(dǎo)者Smad (Co-Smad:Smad4)和抑制性Smads(I-Smads:Smad6、7)。其中Smad1、Smad5和Smad8,可能還有Smad9涉及BMPs的信號傳導(dǎo)。與Smad1和Smad5相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有核心結(jié)合蛋白A1 (core binding factor A1, CBFA1)、鳥氨酸脫羧酶拮抗酶(ornithine decarboxylase antizyme, OAZ)、Smad相互作用蛋白-1(smad- interacting protein 1, SIP1)、蟾蜍腹側(cè)形成同源框蛋白-2(xenopus ventralizing homeobox protein-2, Xvent-2)、激活蛋白-1 (activating protein-1, AP-1)、生長抑素(sandostatin, Ski)、抗增殖蛋白(antip roliferative proteins, Tob)、同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子-8(homeodomain-containing transcription factor-8, Hoxc-8)等。其中CBFA1與TGF-β和BMP-2信號傳導(dǎo)有關(guān),能與Smad1、2、3、5相互作用,在骨形成中起重要作用。 目的 MSCs的多組織來源性,與筋膜結(jié)締組織支架的全身分布性具有一致性,其橫向、縱向分化的生物學(xué)特性,與筋膜結(jié)締組織對機(jī)體的支持儲備作用也是一致的。ADSCs是筋膜中未分化干細(xì)胞的一種儲備形式。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠筋膜結(jié)締組織皮下脂肪作為組織來源,分離培養(yǎng)ADSCs,并對其表型鑒定,探討筋膜結(jié)締組織中對機(jī)體產(chǎn)生支持儲備作用的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)；研究ADSCs是否表達(dá)與骨損傷修復(fù)密切相關(guān)的BMP信號通路相關(guān)分子；骨損傷后,ADSCs在成骨修復(fù)損傷過程中其表面BMP受體和Smads的表達(dá)是否增加,BMP信號通路相關(guān)分子的表達(dá)是否增加。 1、通過細(xì)胞分離培養(yǎng)判斷非特異性筋膜結(jié)締組織中是否存在未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞,以及這種干細(xì)胞的相關(guān)特性； 2、通過RT-PCR技術(shù)觀察ADSCs中BMP信號通路相關(guān)分子的表達(dá),以證實(shí)ADSCs是否表達(dá)BMP信號通路相關(guān)分子； 3.探索骨損傷后,在修復(fù)損傷的過程中自體ADSCs表面BMP受體和Smads的表達(dá)變化。 方法 1、取2月齡Wistar雌性大鼠腹股溝部皮下脂肪組織,采用酶消化法分離、培養(yǎng)脂肪源干細(xì)胞。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、功能學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)鑒定非特異性筋膜結(jié)締組織中的脂肪源干細(xì)胞細(xì)胞是否符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性以及部分表面標(biāo)志,以驗(yàn)證非特異性筋膜結(jié)締組織中是否含有間充質(zhì)干細(xì)胞。 2、將第4代ADSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)和成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后,分別進(jìn)行相應(yīng)的堿性磷酸酶、茜素紅和油紅O染色,以鑒定ADSCs的分化潛能。同時(shí)取培養(yǎng)的第四代ADSCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測部分表面抗原,證明ADSCs的干細(xì)胞特性。 3、提取培養(yǎng)的第4代ADSCs的總RNA進(jìn)行RT-PCR,檢測BMP信號通路相關(guān)分子mRNA的表達(dá)。 4、30只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對照組(A組5只)、實(shí)驗(yàn)組(B組25只)。A組不做處理,直接取腹股溝脂肪墊進(jìn)行ADSCs培養(yǎng)。B組制造骨缺損模型。分別于造模后第1、3、7、14、21天,取腹股溝脂肪組織進(jìn)行ADSCs培養(yǎng),每次均取5只。原代培養(yǎng)第7天,提取ADSCs(?)總RNA,進(jìn)行RT-qPCR檢測骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體(Bone morphogenetic protein receptor, BMPRs)和Smads的mRNA表達(dá)變化。 結(jié)果 1、光學(xué)顯微鏡下觀察貼壁ADSCs形態(tài)多呈梭形、多邊形,細(xì)胞大小均勻； 2、流式細(xì)胞術(shù)鑒定ADSCs的表面抗原顯示CD29、CD90、CD106呈陽性,CD11b、CD45、CD49d呈陰性； 3、ADSCs在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后,油紅O染色顯示特異性脂滴,而陰性對照孔中未觀察到紅染的脂滴。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后,茜素紅染色顯示礦化結(jié)節(jié)呈特異性的粉紅色,陰性對照孔中未見被染成粉紅色的鈣結(jié)節(jié)； 4、RT-PCR檢測結(jié)果顯示ADSCs中BMP信號通路相關(guān)分子Bmprla、Bmpr1b、Bmpr2; Smad1、Smad5、Smad8的mRNA均陽性表達(dá)。 5、RT-qPCR檢測顯示,大鼠在骨缺損刺激后,ADSCs中Bmprla、Bmpr1b、Bmpr2和Smad1、Smad5、Smad8的mRNA表達(dá)量增加。 結(jié)論 1、通過本實(shí)驗(yàn),筆者認(rèn)為在發(fā)育成熟Wister大鼠的筋膜結(jié)締組織的脂肪中存在多能干細(xì)胞,而且可通過消化-貼壁-傳代的程序分離得到這些ADSCs;為筋膜結(jié)締組織對機(jī)體發(fā)揮著支持與儲備作用(干細(xì)胞儲備)提供實(shí)驗(yàn)支持,即筋膜結(jié)締組織中的ADSCs為機(jī)體損傷修復(fù)提供細(xì)胞來源。 2、ADSCs具有成體間充質(zhì)干細(xì)胞特性,具有多向分化潛能,經(jīng)定向誘導(dǎo)培養(yǎng)后可向成骨和成脂肪分化；ADSCs可能存在BMP信號通路。 3、ADSCs表達(dá)BMP受體,表達(dá)BMP信號通路相關(guān)分子,骨損傷可引起大鼠ADSCs中BMP信號通路相關(guān)分子表達(dá)增加。 綜上所述,本研究分別采用了細(xì)胞分離培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù),成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及檢測等技術(shù)手段,從ADSCs形態(tài)特征,成脂、成骨誘導(dǎo)、表面標(biāo)志等方面探討ADSCs。證實(shí)在發(fā)育成熟大鼠的結(jié)締組織中存在間充質(zhì)干細(xì)胞,提示分布于全身的筋膜結(jié)締組織支架很可能就是機(jī)體內(nèi)在的“干細(xì)胞庫”。這種干細(xì)胞易于分離培養(yǎng),具有良好的增殖、分化能力。筆者認(rèn)為ADSCs是筋膜中間充質(zhì)干細(xì)胞的一種主要細(xì)胞儲備形式,更重要的是筋膜結(jié)締組織對機(jī)體的支持與儲備起著細(xì)胞儲備作用,為機(jī)體損傷修復(fù)提供干細(xì)胞支持。 通過RT-qPCR技術(shù),從分子水平檢測證實(shí)ADSCs表達(dá)與骨損傷修復(fù)密切相關(guān)的BMP信號通路相關(guān)分子,而且在骨損傷可引起大鼠ADSCs中BMP信號通路相關(guān)分子表達(dá)增加。提示骨損傷后,在骨損傷修復(fù)過程中,ADSCs可能參與修復(fù)損傷。機(jī)體可能通過產(chǎn)生某種活性物質(zhì)作用,如細(xì)胞因子,炎癥介質(zhì)等,動員自身“干細(xì)胞庫”在機(jī)體正常更新、損傷后的修復(fù)中發(fā)揮支持儲備作用,為機(jī)體修復(fù)損傷提供干細(xì)胞來源。進(jìn)一步驗(yàn)證了“筋膜學(xué)”理論所提及的損傷修復(fù)機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2344590