【摘要】：引言 人巨細(xì)胞病毒(HCMV)是一種229kb的雙鏈DNA染色體的皰疹病毒科病毒,HCMV感染是兒童常見的感染性疾病。由于HCMV產(chǎn)生的病毒因子逃逸宿主免疫,機(jī)體無法徹底清除病毒。目前研究表明,HCMV的復(fù)制和感染需要依賴其病毒的包膜糖蛋白,后者在識別宿主細(xì)胞膜受體、吸附和穿入宿主細(xì)胞、病毒的致病力以及誘導(dǎo)宿主反應(yīng)等方面起重要作用。HCMV病毒感染細(xì)胞的過程是從病毒包膜糖蛋白與靶細(xì)胞膜表面受體結(jié)合開始的,結(jié)合后HCMV以膜融合或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞。因此,阻遏HCMV糖蛋白與靶細(xì)胞膜的結(jié)合是控制HCMV感染的重要切入,點(diǎn)。 DC細(xì)胞表面的特異性細(xì)胞間黏附因子3結(jié)合非整合素分子(dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin, DC-SIGN)是一種帶有外部甘露糖結(jié)合位點(diǎn)的C型凝集素結(jié)構(gòu)域的Ⅱ型膜蛋白,能識別多種病原體如病毒、細(xì)菌、蠕蟲和真菌,在DC細(xì)胞識別模式中起重要作用。 天然免疫分子甘露(聚)糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin, MBL)系C型凝集素超家族成員之一,可與病毒表面多種糖基高效結(jié)合組成了機(jī)體抗病毒的第一道防線且參與感染進(jìn)程的調(diào)控。目前未見將MBL應(yīng)用于HCMV感染的研究報道。 本研究研制和純化重組MBL (rMBL),從人血漿中純化出天然MBL (hMBL),從人外周血單個核細(xì)胞中分離培養(yǎng)出高表達(dá)DC-SIGN的DC細(xì)胞(monocyte-derived dendritic cell, MD-DC);研究不同濃度的hMBL/rMBL在阻遏MD-DC捕獲HCMV,和阻遏HCMV在MD-DC間擴(kuò)散的功能上的作用差異及時間點(diǎn),并初步探討其機(jī)制。 方法 1、構(gòu)建表達(dá)人野生型MBL的中國倉鼠卵巢細(xì)胞 構(gòu)建含野生型MBL的pNOW/CMV-A表達(dá)載體,參照Ohtaniet al方法并加以改進(jìn)。用上述載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞株,按Transfast說明書配制轉(zhuǎn)染試劑并進(jìn)行轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的CHO細(xì)胞,用G418篩選抗性細(xì)胞即穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,熒光定量PCR分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株MBL基因的表達(dá),用ELISA法檢測MBL蛋白濃度。 2、rMBL和hMBL的純化,定量和SDS-PAGE鑒定純度 CHO/MBL細(xì)胞在含20%小牛血清的MEDM培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。取培養(yǎng)上清和人新鮮血漿進(jìn)行甘露聚糖-Sepharose4B親和層析純化。SDS-PAGE鑒定純度,考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行蛋白定量。 3、MD-DC細(xì)胞的獲得 MD-DC是從人外周血濃縮單個核細(xì)胞(PBMC)分離培養(yǎng)而來,rhGM-CSF和rhIL-4刺激培養(yǎng),第3天半量更換含細(xì)胞因子的培養(yǎng)液,第6天收獲細(xì)胞。 4、MBL阻遏MD-DC細(xì)胞捕獲HCMV功能 取新收獲的,培養(yǎng)第6天的克隆增長的MD-DC,用不同濃度的hMBL/rMBL預(yù)處理DC細(xì)胞半小時后,再以HCMV感染MD-DC細(xì)胞2小時,熒光定量PCR檢測MD-DC內(nèi)HCMV-DNA拷貝數(shù)。MD-DC捕獲HCMV-DNA拷貝數(shù)的百分?jǐn)?shù)(%)=捕獲的HCMV-DNA拷貝數(shù)／初始加入的HCMV-DNA拷貝數(shù)×100。結(jié)果經(jīng)SPSS軟件16.0統(tǒng)計學(xué)分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測MD-DC內(nèi)HCMV-PP65陽性率(PP65為HCMV的一種特異蛋白,2%為陽性,0.5%為陰性,0.5%-2%為可疑陽性)。用PKH26紅色熒光標(biāo)記HCMV,用CD209-FITC綠色標(biāo)記MD-DC細(xì)胞表面的DC-SIGN。通過激光共聚焦直接觀察DC-SIGN對HCMV的捕獲情況,用"imaginj"軟件定量分析單位細(xì)胞面積內(nèi)的病毒量,結(jié)果經(jīng)SPSS軟件16.0統(tǒng)計學(xué)分析。 5、MBL阻遏HCMV在MD-DC細(xì)胞間擴(kuò)散 取新收獲的,培養(yǎng)第6天的克隆增長的ND-DC,經(jīng)HCMV感染2小時后,將MD-DC和不同濃度的hMDL/rMBL共培養(yǎng)3天,在第24小時、第48小時,第72小時用經(jīng)熒光定量PCR檢測MD-DC內(nèi)HCMV-DNA拷貝數(shù)。MD-DC內(nèi)HCMV-DNA拷貝數(shù)的百分?jǐn)?shù)(%)=MD-DC內(nèi)HCMV-DNA拷貝數(shù)／初始加入的HCMV-DNA拷貝數(shù)×100。結(jié)果經(jīng)SPSS軟件16.0統(tǒng)計學(xué)分析。在第72小時用流式細(xì)胞術(shù)比較MD-DC內(nèi)HCMV-PP65蛋白陽性率,明確MBL阻遏HCMV在MD-DC間擴(kuò)散的功能。 結(jié)果： 1、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞目的基因表達(dá)效果檢測結(jié)果：RT-Q-PCR技術(shù),檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞目的基因表達(dá)效果,篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株中,CHO-MBL目的基因表達(dá)是轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞株的103倍以上。 2、純化到大量的hMBL/rMBL:在800ml的CHO/MBL培養(yǎng)上清中,能純化到447.86ug rMBL；從200ml人血漿中純化出420.92ug hMBL。純化蛋白電泳：血漿MBL還原電泳可見26KD和32KD兩種單體、52KD二聚體、78KD三聚體；血漿MBL非還原電泳均為＞170KD之多聚體；重組MBL還原電泳,可見32KD單體；重組MBL非還原電泳：均為＞170KD之多聚體。 3.MD-DC的培養(yǎng)：人外周血單個核細(xì)胞經(jīng)rhGM-CSF和rhIL-4刺激后,第6天收集MD-DC。光鏡下觀察MD-DC形態(tài)：可見細(xì)胞成簇懸浮生長,形態(tài)不規(guī)則,可見偽足。電鏡下MD-DC形態(tài)具有典型的樹突樣特征。用流式細(xì)胞儀檢測到表達(dá)DC的特征性標(biāo)志：MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40.用抗DC-SIGN的單克隆抗體CD209-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測DC-SIGN百分?jǐn)?shù)達(dá)88%。 4、不同濃度的hMBL/rMBL阻遏MD-DC捕獲HCMV的作用 熒光定量PCR法檢測MD-DC內(nèi)HCMV-DNA的拷貝數(shù),經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,與對照組相比,1μg/ml的hMBL組和1μg/ml rMBL組均無顯著性差異,而5μg/ml和10μg/ml的hMBL組,5μg/ml和10μg/mlrMBL組均具有顯著性差異。各種濃度的hMBL組和rMBL組兩兩比較均值均偏低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。流式細(xì)胞儀檢測MD-DC內(nèi)HCMV-PP65的陽性率,陰性對照組為陽性,10μg/ml濃度的hMBL/rMBL組均為可疑陽性。激光共聚焦技術(shù)下經(jīng)定量檢測單位細(xì)胞面積內(nèi)的病毒量,10μg/ml濃度的hMBL/rhMBL具有明顯的阻遏MD-DC捕獲HCMV的作用。 5、不同濃度的hMBL/rMBL阻遏HCMV在MD-DC間擴(kuò)散的功能結(jié)果 經(jīng)HCMV感染后的MD-DC和不同濃度的hMBL/rMBL共培養(yǎng)3天,結(jié)果經(jīng)熒光定量PCR檢測,與對照組相比,在共培養(yǎng)的第24小時和第48小時各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均無顯著差異。而在共培養(yǎng)第72小時檢測時,1μg/ml的hMBL/rMBL組和對照組相比,結(jié)果無顯著性差異。5μg/ml和10μg/ml的hMBL/rMBL組與對照組相比均有顯著性差異。各種濃度的hMBL組和rMBL組兩兩比較均值均偏低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在第72小時用流式細(xì)胞術(shù)比較細(xì)胞內(nèi)HCMV PP65蛋白陽性率,10μg/ml的hMBL/rMBL孵育組也明顯低于對照組。 結(jié)論 1、成功建立分泌rMBL細(xì)胞株(CHO/rMBL),獲得大量高純度的rMBL和hMBL; 2、成功從人外周血單個核細(xì)胞分離培養(yǎng)出高表達(dá)DC-SIGN的MD-DC; 3、MD-DC具有捕獲HCMV的功能,HCMV能在MD-DC間擴(kuò)散； 4、生理濃度的hMBL和rMBL能顯著阻遏MD-DC捕獲HCMV以及HCMV在MD-DC間的擴(kuò)散,rMBL效果似較hMBL略差。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 段學(xué)章,王福生,王敏,莊輝,劉敬超,胡瑾華,李捍衛(wèi),張玲霞;乙型肝炎患者外周血Ⅱ型樹突狀細(xì)胞表型和功能鑒定及其意義的研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2003年07期

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本文編號：2343973